1. Использование протеолитических ферментов

Протеолитические ферменты различной специфичности или смесь протеолитических ферментов (таких, как пролаза) могут использоваться для солюбилизации NA* в активной форме. Это свидетельствует, во-первых, что активный центр NA* в высокой степени устойчив к протеолизу и, во-вторых, что отрыв гидрофобного «хвоста» может быть осуществлен практически любым протеолитвческим ферментом. Для отщепления необходимо наличие нескольких ключевых аминокислот; произойдет ли гидролиз в том или другом месте — не имеет большого значения. Протеолитические ферменты обычно попользуются в высоких концентрациях (1—2 мг/мл и выше), которые сравнимы с .концентрацией вирусных (белков при малом времени инкубации. Поскольку NA* вируса находится в «нативном» состоянии, она, по-видимому, более устойчива к протеолизу, чем после денатурации фермента. Углеводные остатки NA* могут играть роль «защитников» фермента от атаки протеолитичеокими ферментами, а также «направлять» протеолитические ферменты к специфическим областям, в которых должен произойти разрыв цепи. Что касается ферментов, используемых для солюбилпзации NA*, то следует отметить, что трипсин, обладая наивысшей из всех

известных эндопептидаз степенью специфичности места разрыва, расщепляет |бело,к в области карбоксильного конца остатков лизина и аргинина (Walsh, 1970). Химотрипсин расщепляет белок преимущественно по ароматическим аминокислотам полипептидной цепи (Wilcox, 1970). Пептидаза На-гарсе (или субтилизин BPN') является сериновой протеазой, расщепляющей большое число пептидных и эфирных связей (Ottesen, Svendsen, 1970). Проназа представляет собой смесь нескольких протеолитических ферментов, включая эндопеп-тидазу и экзопептидазу, .продуцируемые штаммом Streptomy-ces griseus K-l (Narahachi, 1970).

2. Использование детергентов

Детергенты, используемые для изоляции вирусных <NA:1\ можно разбить на две основные группы: ионные (преимущественно анионные) и неионные детергенты. К числу основных детергентов первой группы, используемых для солюбилизации NA* с сохранением ее ферментативной активности, следует отнести додецилсульфат натрия (SDS) и дезоксихолат натрия. Оба вещества относятся к числу сильных детергентов анионного типа. NA* штаммов A0(Nl) чувствительна к SDS (Gregoriades, 1972; Laver, Baker, 1972) и инактивирует-ся в присутствии этого детергента, в то время как NA* штаммов А2 (N2) может быть изолирована с помощью SDS-co-любилизации. Отношение 2:1 по массе белка к детергенту является оптимальным для изоляции NA* типа ;N2 с сохранением ее активности (Laver, 1963; Rott et al.. 1970). Использованные ранее неионные детергенты относились к серии твинов: твин-20 или твин-80, часто в смеси с эфиром. Позднее использовали детергент NP40 (Gregoriades, 1972) и тритон Х100 (Bucher, 1973, 1975). Неионные детергенты обычно обладают более низкой инактивирующей способностью, чем ионные. Как и в случае протеолитических ферментов, тип детергента не оказывает существенного влияния на свойства выделяемого фермента в случае, если не происходит его инактивации.

Успешное выделение NA* в активном состоянии с помощью электрофореза в целлюлозоацетатных пластинах (Laver, 1963, 1964) в присутствии SDS зависит от того, имеем ли мы дело с SDS-чувствительным НА* и SDS-нечувствительной NA*, После разрушения вирусных частиц с помощью SDS NA*, мигрирующая под действием эндооомотического потока, движется к катоду и отделяется от НА*. Для штаммов типа А2 НА* и NA* мигрируют совместно (к катоду), и для выделения NA* требуется провести генетическую рекомбинацию с более ранними вариантами вируса гриппа для того, чтобы получить НА*, инактивируемый в присутствии SDS (мигрирующий к аноду). NA штамма NWS (N1) денатурирует в присутствии SDS.

Б. ОЧИСТКА НЕЙРЛМИНИДАЗЫ

Вслед за солюбилизацией NA* из препаратов очищенного вируса ее можно выделить с использованием комбинации се-диментационных, хроматографических и (или) электрофоре-тических методов. Поскольку активный фермент имеет константу седиментации 8—10S, а другие вирусные компоненты могут иметь более низкие или 'более 'высокие скорости седиментации, обычно первым этапом очистки является ультрацентрифугирование, выполняемое чаще с использованием градиента либо сахарозы, либо глютамата натрия. Последний метод удобен тем, что при его использовании можно прямо измерить активность NA* с помощью тиобарбитуровой кислоты без нежелательного влияния сахарозы (Biddle, 1968). С помощью относительно низкоскоростного центрифугирования обычно отделяют NA* от вирусных частиц, а при втором центрифугировании с более высокой скоростью или с более крутым сахарозным градиентом отделяют медленно седимен-тирующие вирусные белки от NA*, которая седиментирует с большей скоростью.

Последующие этапы очистки обычно включают хромато-графические методы разделения макромолекул либо по размерам, 1как в случае гель-фильтрации с использованием се-фадекса G-200 или биогеля Bio-Red A5 (Kendal et al., 1968; Bucher, Kilbourne, 1972), либо методы разделения с использованием ионообменных смол, таких, как DEAE-целлюлоза, на которой NA* типа iNl довольно эффективно адсорбируется при нейтральных значениях рН (Gregoriades, 1972). Laver (1963, 1964) использовал метод электрофореза на целлюло-зоацетатных пластинах в присутствии SDS. В связи с тем что метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS позволяет проводить разделение 'макромолекул по размерам (Weber, Osborne, 1969), этот вид электрофореза был использован для выделения NA* вируса гриппа (Bucher, Kilbourne, 1972). Для изоляции из смеси белков солюбили-зированной с помощью детергентов NA* использовали и метод электрофокусировки (Gregoriades, 1972). Очистить NA* благодаря ее ферментативной активности можно методом афинной хроматографии при использовании колонки с низкомолекулярным ингибитором нейраминидазной активности — N-p-аминофенилоксамовой кислотой (Cuatrecasas, II-liano, 1971; Bucher, 1973, 1975). Если учесть, что NA* вируса гриппа представляет собой гликопротеид, ее можно выделить, используя афинную хроматографию с использованием лекти-нов (Hayman et al., 1973).

В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ

После изоляции NA* из вирионов можно использовать несколько ^ критериев ее чистоты. Один из них — увеличение удельной активности в стандартных условиях. Если принять, что NA* составляет 7% всех белков вириона, то максимальное увеличение удельной активности препарата может составлять 14—15 раз. Однако этот критерий очень трудно использовать на практике, поскольку, с одной стороны, имеет место увеличение активности . NA* при выходе ее из вириона, а с другой — на ее активность одновременно влияет большое число денатурирующих факторов в зависимости от условий солюбилизации и типа используемого штамма вируса. В связи с этим очень трудно судить о степени очистки NA*, основываясь на ее удельной активности.

В качестве критерия чистоты препарата NA* использовали отсутствие адсорбции его на эритроцитах, однако, несмотря на наличие этого свойства, препарат все же может сохранять способность к индукции антител к НА* (Wilson, Rafelson, 1963; Drzeniek, Rott, 1963). Таким образам, дополнительным критерием степени чистоты выделенной NA* может быть то, что при ее использовании в качестве иммуногена не продуцируются антитела к другим компонентам вириона.

Поскольку в настоящее время: хорошо известно положение полосы NA* при электрофорезе в полиакриламидном геле, одним из критериев ее чистоты может быть присутствие одной полосы высойомолекулярногб гликопротеида при проведении электрофореза в невосстанавливающих условиях. После восстановлений эта полоса должна превратиться, в одну или две полосы, положение которых соответствует относительной молекулярной массе приблизительно 60 000 при полном отсутствии других полос. В этом случае на полиакрил-амидный гель следует нанести 5—10 мкг белка