VI. Свойства изолированной нейраминидазы а. Состав аминокислот

В связи с тем что NA*, полученная при действии на вирно-ны SDS, после удаления детергента агрегирует «хвостами», вероятно, за счет их гидрофобных свойств (см. 20; Laver, Valentine, 1969), и поскольку известно, что эти части молекулы NA* отщепляются при лротеолизе (Lazdins et al., 1972; Wrigley et al., 1973), интересно сравнить общее число полярных и неполярных остатков для NA* типа N2 (X7/F1), полученной с помощью детергентного (Laver, Baker, 1972) и лро-теолитического (Kendal, Eckert, 1972) методов. Естественно, что более надежно было бы провести такое сравнение, используя данные, полученные одной группой исследователей, однако, к сожалению, таких результатов в настоящее время еще нет. Если считать, что полярными аминокислотными остатками являются лизин, гистидин, аргинин, асларагино-вая кислота, треонин, серии и глутаминовая .кислота, то среди 535 аминокислотных остатков (см. ранее) имеется 280 полярных для NA*, выделенной с помощью детергентного метода, и 264 полярных остатка для фермента, изолированного с помощью протеолиза, т. е. в последнем случае наблюдается дефицит 6% полярных остатков. Если в качестве неполярных остатков рассматривать пролин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин и суммарный цистеин, можно видеть, что в NA*, изолированной с помощью детергента, содержится 186 неполярных остатков, a NA*, полученная при действии протеолитического фермента, включает 171 неполярный остаток, т. е. в процессе обработки ферментом теряется 8% неполярных аминокислотных остатков. Таким образом, аминокислоты в области, которая теряется при лро-теолизе молекулы NA*, не являются в значительной степени более гидрофобными, чем аминокислоты, входящие в состав активной части молекулы. Вероятно, конформация шолипеп-тидной цепи гораздо -более важна для создания гидрофобного характера этой области, чем тип аминокислот, входящих в ее состав.

Число остатков лизина и аргинина представляет интерес в связи с изучением пептидных карт гидролизатов нейраминидазы, полученных с помощью трипсина. Kendal и Eckert (1972) определили, что в каждой субъединице содержится 50,1 остатка лизина и аргинина, Layer и Baker дают величину 57,0 остатков. Данные по общему числу цистеиновых остатков этих авторов также существенно; отличаются. Kendal и Eckert (1972) определили 21 остаток: цистеина,.Laver и Baker (1972) — 14. Эти исследователи нашли также различное число метиониновых остатков:: для одного и того :же типа нейраминидазы Kendal и Eckert (1972) приводят величину 9,3, a Laver и Baker (1972) —5,9. Содержание остатков метиони-на в нейраминидазе важно для исследования структуры этого фермента, с , помощью его расщепления цианидом'брома,

которое происходит .по остаткам метионина. Основываясь на работе Kendal и Eckert (1972), можно предположить, что в результате такого расщепления образуется 9—10 фрагментов, а на основании работы Laver и Baker (1972) таких фрагментов должно наблюдаться 6 или 7. Для разрешения этого противоречия требуются дополнительные исследования по определению состава аминокислот.

Очень мало известно об углеводной части нейраминидаз-■ного гликопротеида. По Kendal и Eckert (1972), в молекуле фермента содержится 5,7 остатка глюкозамина. Lazdins и соавт. (1972) сообщили о потере при выделении нейраминида-зы с помощью протеолитических ферментов в области макромолекулы с высоким содержанием глюкозамина.

Б. АМИНОКИСЛОТЫ АКТИВНОГО ЦЕНТРА

Некоторые исследователи пытались определить природу аминокислотных остатков, входящих в активный центр NA*, однако полученные результаты были неоднозначны. Hoyle (1969) привел доказательства присутствия остатков тирозина и гиетидина в активном центре и не сделал 'каких-либо определенных заключений об остатках цистеина, метионина, триптофана, аргинина и лизина. С другой стороны, Bachmayer (1972), проведя исследование с N-бромсукцинимидной модификацией, с большой уверенностью указывает на наличие в активном центре триптофана. Изолированная с помощью проназы NA* вируса гриппа типа А2 (N2) полностью теряла свою активность после обработки N-бромсукцинимидом. Субстраты NA*, такие, как сиалиллактоза или фетуин, предохраняют фермент от подобного рода инактивации.

В. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ТОЧКА

Изоалектрическая точка была определена для NA*, полученной как протеолитическим (Neurath et al., 1970; Kendal et al., 1973), так и детергентным (Neurath et al., 1970; Grego-riades, 1972) методами. Neurath и соавт. (1970), Kendal и соавт. (1973) обнаружили большие различия в изоэлектри-ческих точках NA* типа N2 в зависимости от того, протеолитическим или детергентным методом был получен фермент. Gregoriades (1972) очищала NA* типа N1 (WSN) с помощью неионных детергентов и получила гомогенный препарат с изоэлектричеокой точкой pi 6,0. Kendal я соавт. (1973) обнаружили при изоэлектрическом фокусировании NA* типа N2 по крайней мере 6 пиков в пределах pi от 5,2 до 6,5 с основными пиками в области 5,5—5,8. В обоих случаях изоэлектрическая точка была слегка сдвинута в кислую область. Денатурированная NA* (Kendal et al., 1973) имела изоэлектрическую точку на 1,5—2,0 единиц рН ниже, чем нативный фермент, что указывает на возможное конформационное маскирование в нативной молекуле NA* большого количества боковых карбоксильных групп. Для NA*, выделенных из штаммов A2/Aichi/68 и B/Mass/66, Neurath и соавт. (1970) обнаружили пики pi в пределах рН от 5 до 9. Это указывает на то, что изоэлектрическая точка у вирусной NA* ближе к нейтральным значениям рН, чем у NA* Clostridium perfringens (pi 4,95) или Vibrio cholerae (pi 4,80), которые имеют фиксированные значения изоэлектрических точек. Neurath и соавт. (1970) не использовали детергент в опытах по электрофокусированию, хотя сама NA* была получена из вирионов с помощью детергента и в связи с этим возможным объяснением гетерогенности изоэлектрической точки может быть эффект агрегации. Gregoriades (1972) получила фиксированную изоэлектрическую точку при рН 6,0 для NA*, изолированной с помощью детергента в присутствии в среде неионных детергентов. Можно ожидать, что препарат NA*, выделенный с помощью обработки протеолитическими ферментами, гетерогенен за счет возможной множественности мест разрывов полипептидной цепи. Однако Kendal и соавт. (1973) обнаружили гетерогенность NA* даже после того, как отделили индивидуальный пик после изоэлектрофокусировки и снова нанесли его на фокусирующую колонку.