III. Транскрипция а. Последовательность синтеза рнк

После «раздевания» онРНК вириона должна быть транскрибирована в комплементарную РНК- Вводимая с инфицирующей частицей РНК-полимераза должна функционировать в первой стадии размножения вируса (см. гл. 5). Геном вируса гриппа может быть выделен из вирионов только в виде

отдельных фрагментов (см. гл. 6). Более того, он и функционирует в виде -отдельных фрагментов, как 'было показано генетическим анализом (ом. гл. 7) и ступенчатой инактивацией инфекционного вируса (Scholtissek, Rott, 1964). В связи с этим следует предположить, -что полимераза инициирует синтез РНК в каждом индивидуальном фрагменте. Поскольку РНК не существует в клетке в виде свободной молекулы, а всегда одета белком, возникает вопрос: с каким белком связана вирусная РНК в процессе своей репликации?

Опыты, проводимые три изучении синтеза РНК вируса гриппа, представляют большие трудности, поскольку актино-мицин D не может быть использован для выявления продукции вирусной РНК при специфическом подавлении синтеза клеточных РНК, так как этот антибиотик подавляет размножение вируса гриппа (Barry et al., 1962; Rott, Scholtissek, 1964; Barry et al., 1965; Pons, 1967). По этой причине для определения последовательности синтеза РНК во времени применили специфическую гибридизацию пульс-меченной РНК в различные моменты после заражения с избытком либо немеченой вРНК, либо вкРНК с последующей обработкой РНК-азой (Scholtissek, Rott, 1970). В ранних стадиях инфекционного цикла превалировал синтез вкРНК, достигая максимума примерно «о второму часу после заражения, тогда как в поздних стадиях большая часть продуцируемой вирус-специфической РНК являлась вРНК. Krug (1972), используя другой метод, также показал, что через 4 ч после заражения синтез BIKPHK ПОЧТИ ПОЛНОСТЬЮ прекращается. После экстракции фенолом обнаруживается относительно небольшое количество днРНК (Scholtissek, Rott, 1970).

В связи с тем что тот или другой тип вирусной РНК обладает информационным1!! функциями и используется как матрица для синтеза вирусных белков (см. раздел IVA), может иметь место некоторый трансляционный контроль на уровне дифференциального катаболизма вирусной РНК. Поэтому были проведены иульс-чейз-эксперименты для изучения стабильности РНК вируса гриппа in vivo. Установлено, что в противоположность клеточной РНК оба типа вирусной РНК полностью стабильны в течение 90-шшутного периода ченза (Scholtissek et al., 1972).

Ранее при исследовании синтеза вирусной РНК in vivo, когда актиномицин D добавляли в поздних стадиях инфекционного цикла (Duesberg, Robinson, 1967; Nayak, 1970; Ма-hy, 1970), не учитывали, что антибиотик специфически инги-бирует синтез комплементарной РНК in vivo (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Поскольку днРНК выделяется из зараженных клеток в виде по крайней мере пяти отдельных фрагментов, был сделан вывод, что вирусная РНК также синтезируется в виде фрагментов (Pons, Hirst, 1968).

Б. ЛОКАЛИЗАЦИЯ СИНТЕЗА ВИРУСНОЙ РНК ВНУТРИ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА

Из данных, полученных при радиоавтографии, был сделан вывод, что местом синтеза вирусной РНК являются, по-видимому, ядра клеток (Scholtissek et al., 1962; Barry et al., 1974). Поскольку периоды пульса, применявшиеся в этих исследованиях, -были все еще слишком большими, нельзя исключить, что вирусная РНК синтезируется в цитоплазме клетки и после этого транспортируется в ядра, где она может накапливаться. Кроме того, ,вРНК и вкРНК могут синтезироваться в клетке в различных местах.

В. ИНГИБИРОВАНИЕ СИНТЕЗА ВИРУСНОЙ РНК 1. Актимомицин D, митрамицин и а-аманитин

При добавлении актиномицина D или митрамицина, которые препятствуют матричной функции ДНК, к зараженным клеткам в момент, когда там уже присутствует вирусная РНК-зависимая РНК-иолимераза (например, через 2 ч после инфекции), вРНК продолжает синтезироваться в течение еще примерно 2 ч. Продукция вкРНК, однако, немедленно прекращается. Позже синтез вРНК также падает, указывая на то, что для него необходимо непрерывное образование вкРНК (Rott et al., 1965; Scholtissek, Rott, 1970; Scholtissek et al., 1970; Pons, 1973). Gregoriades (1970) показала, что актино-мицин D оказывает также сильное влияние на синтез вРНК при добавлении в поздних стадиях инфекционного цикла. В этих опытах синтез вирусной РНК определяли по увеличению включения меченого уридина в тотальную РНК зараженных клеток. Такое увеличение может быть устранено добавлением актиномицина D. Однако следует иметь в виду, что заражение вирусом гриппа вызывает увеличение включения меченого уридина в клетку после инфекции (Scholtissek et al., 1967) и что актиномицин D оказывает ингибирующее влияние на это включение (Scholtissek et al., 1969). сиАмани-тин, который не имеет сродства к ДНК, &о влияет на активность одной из клеточных РНК-полимераз (РНК-подимера-за II), также ингибирует синтез вкРНК при добавлении в культуральную жидкость сразу же после заражения (Rott, Scholtissek, 1970; Mahy et al., 1972).

Механизм 'Специфического ингибирования этими антибиотиками синтеза вкРНК не совсем понятен, так как они не оказывают влияния на образование вкРНК in vitro. Таким образом, эти антибиотики действуют только in vivo, хотя фермент, синтезирующий вкРНК, может быть выделен из клеток, к которым через 2 ч после инфекции был добавлен актиномицин D (Scholtissek, Rott, 1969a).

Размножение 'вирусов гриппа может 'быть подавлено также другими воздействиями на ДНК клетки-хозяина — введением митомнцина С, предобработкой ультрафиолетовым облучением или удалением ядер клетки перед инфекцией (Barry, 1964; Rott et al., 1965; Nayak, Rasmussen, 1966; Fol-.lett et al., 1974; Kelly et al., 1974). Механизм, с помощью которого эти воздействия влияют на размножение .вируса гриппа, может 'быть одинаковым с механизмом действия других антибиотиков. Единственное предположение, 'которое можно сделать на основании этих исследований, это то, что имеется необходимость в 'функционально 'активных ядрах клетки и (или) в ДНК-зависимой функции клетки для размножения вирусов гриппа. Что ■это за функции—сказать нельзя.