8. Вирусы гриппа в и с

Исследование химического состава и структуры вирионов, а также содержащихся в них белков было выполнено в основном на штаммах вирусов гриппа А. В некоторых работах, однако, в качестве объекта изучения использовали штамм Lee вируса гриппа В. В основном была показана идентичность химического состава и структуры вирусов гриппа Аи В (Haslam et al., 1970b; Lazdins et al., 1972; Laver, Baker, 1972; Oxford, 1973; Tobita, Kilbourne, 1975). Однако некоторые небольшие, но существенные различия -были найдены для штамма GL/1760/54 вируса гриппа В (Choppin et al., 1975). Этот вирус, выращенный на клетках почки хомячка, не имел белка Р, а сравнение злектрофоретического профиля белков вируса этого штамма и штамма WSN вируса гриппа А показало, что белки НА, NP и NA штамма GL/1760 имеют несколько большую молекулярную массу (относительная молекулярная масса была равна соответственно 82 000, 66 000 и 64 000), в то время, как М-белок штамма GL/1760 (молекулярная масса — 24 000) был несколько меньше, чем М-белок штамма WSN. На 3 представлен электрофоретичеокий профиль в полиакриламидном геле белков штамма B/GL/1760. Удивительным фактом, обнаруженным для штамма GL/1760, который выращивали на клетках почий хомячка, было полное отсутствие расщепления белка НА. Тем не менее можно было провести расщепление полипептида НА на фрагменты HAi и НА2 в системе in vitro. Было, кроме того, показано, что полипептиды NA и HAi содержат остатки фукозы, а НА2 их не содержит и в его состав входит глюкозамин. Таким образом, в этом случае в области НА2 гемагглютинина «шипа» наблюдается отсутствие сахарного остатка, обычно локализованного на концах сахарных цепочек. С помощью этой области, как известно, «шип» гемагглютинина присоединяется к вирусной мембране. Отсутствие фукозы в составе полипептида НА2 и наличие ее в составе HAi и >NA этого штамма, а также в составе полипептида НА2 других штаммов указывает на возможное наличие более тесного взаимодействия полипептида НА2 штамма GL/1760 с вирусной мембраной и на то, что это взаимодействие может оказать влияние на процесс гликозидирования, заканчивающийся на поверхности мембраны.

Другим интересным наблюдением, сделанным при анализе экспериментов по /позднему и раннему включению радиоактивных аминокислот в вирион гриппа штамма GL/1760, явилось то, что мембранный белок синтезировался в процессе репродукции относительно поздно, а белок NP, синтезирующийся на ранних этапах инфекционного цикла, инкорпорировался в вирионы, уже содержащие белок М, который синтезируется позднее. Этот результат был получен с помощью метода включения в белки радиоактивных аминокислот на ранних и поздних этапах репродукции (Choppin et al., 1975). Сходные данные были недавно получены для штамма WSN (Meier-Ewert, Compans, 1974). Эти результаты согласуются с высказанным ранее утверждением, что синтез М-белка жестко детерминируется и может являться этапом, на котором контролируется скорость вирусной репродукции (Lazaro-witz et al., 1971).

Относительно мало работ было выполнено с использованием в качестве объекта изучения вируса гриппа С. Выполненное недавно предварительное исследование показало в основном сходность его химического состава с составом вирусов гриппа А и В. Однако следует отметить, что вирус гриппа С не обладал нейраминидазной активностью. Это указывает на то, что этот вирус может содержать в своем составе гликозидазу другого типа, способную разрушать вирусные рецепторы (Kendal, Kiley, 1974).

г. липиды

Липиды, содержащиеся в вирионе гриппа, локализованы в вирусной мембране и, как будет описано далее, существуют в виде двойного липидного слоя. Из 20—24% массы вириона, приходящихся на липиды, основную часть составляют фосфолипиды (ГО—13%) и холестерин (6—8%), а также малый по количеству, но, вероятно, важный компонент — гликолипиды (1—2%) (Frommhagen et al., 1959; Kates et al., 1961; Blough, Merilie, 1970; Klenk et al., 1972a; Klenk, Choppin, неопубликованные данные). Проведенные ранее исследования показали, что предварительно меченные клеточные липиды включаются в вирионы гриппа (Wecker, 1957) и что липидный состав вирионов, культивированных на различных клетках, сходен с липидным составом этих клеток (Kates et al., 1961). Было обнаружено, что клетка-хозяин играет определяющую роль в формировании липидов вируса. Позднее Blough и соавт. проанализировали липидный состав вирусов-гриппа различных штаммов, выращенных на куриных эмбрионах (Tiffany, Blough, 1969; Blough, 1971; Blough, Tiffany, 1973). На основании различий в липидном составе этих вирусов авторы предположили, что состав липидов вируса определяют белки вирусной оболочки за счет селективного взаимодействия между молекулами белков и липидов. Однако наблюдаемые различия касались в основном жирных кислот нейтральных липидов. В связи с тем, что этот компонент составляет лишь небольшую часть от общего липидного содержания вируса и поскольку жирные кислоты полярных липидов, входящие в состав различных штаммов вируса гриппа, в основном сходны, значение указанных выше различий пока еще неясны. Анализ липидного состава был проведен для вирионов, выращенных на куриных эмбрионах в условиях множественного цикла репродукции; штаммы могли различаться по кинетике роста вирусной популяции и по степени влияния на клеточный метаболизм. В связи с этим мог меняться липидный состав мембран хозяйских клеток. Кроме того, анализ липидного состава проводили на вирионах, выращенных в разное время на различных партиях эмбрионов, что также трудно учесть при интерпретации полученных результатов.

Анализ липидного состава вирионов гриппа при их культивировании в более контролируемых условиях клеточных культур имеет очевидные преимущества. Было проведено детальное сравнение липидного состава оболочечных вирусов и плазменных мембран различных клеток, на которых эти вирусы культивировались. Анализировали включение в мембраны фосфолшгадов, холестерина, гликолипидов и жирных кислот (Klenk, Choppin, 1969, 1970а, b; Choppin et al., 1971; Renkonen et al., 1971; Quigley et al., 1971; Laine et al., 1972; McSharry, Wagner, 1971). Хотя в некоторых случаях и наблюдались незначительные различия, липидный состав вирусов был очень сходен с липидным составом плазматических мембран хозяйских клеток. Концентрация фосфолипидов в данном вирусном штамме может отличаться по крайней мере в 3 раза в зависимости от типа клетки-хозяина. Наблюдались также качественные различия в составе гликолипидов (Klenk, Choppin, 1969, 1970b). Кроме того, было показано, что содержание жирных кислот может меняться в 4 раза в зависимости от среды культивирования (Klenk, Choppin, 1970b). Приведенные результаты указывают на то, что, хотя при определенных условиях и могут наблюдаться незначительные вариации в липидном составе вируса гриппа, за которые могут быть ответственны вирусные белки, определяющее влияние на липидную композицию мембраны оказывает клетка-хозяин и что липидный состав вируса повторяет липидный состав плазматических мембран хозяйских клеток.

Однако наблюдаемое сходство липидного состава вирусных и клеточных мембран и утверждение об определяющем влиянии клетки-хозяина на состав липидов вириона совсем не означают, что все липиды, включающиеся в дальнейшем в вирусную частицу, присутствуют в клетке к началу инфекционного процесса. Действительно, тот факт, что для многих оболочечных вирусов вирусная репродукция продолжается в течение длительного периода, указывает на то, что некоторые вновь синтезированные молекулы липидов инкорпорируются в вирионы. Однако сообщение Blough (1974) о том, что вновь синтезированные липиды включаются в состав вириона, совсем неэквивалентно утверждению, что синтез этих липидов определяется вирусом. Это означает только, что биосинтез липидов, которые впоследствии войдут в состав вирусной мембраны, не прекращается после начала инфекции и что при оборке вирусной частицы используются как вновь синтезирующиеся, так и уже предсуществующие в клетке молекулы липидов.

Основное качественное различие между липидами вируса и клетки-хозяина состоит в том, что в вирионах гриппа не обнаруживается гликолипидов, содержащих нейраминовую кислоту (ганглеозиды); нейраминовой кислоты нет также в составе вирусных гликопротеидов (Klenk, Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970b). Отсутствие остатков нейраминовой кислоты в вирионе объясняется включением вирусного фермента нейраминидазы в те области мембраны, которые впоследствии сформируют вирусную оболочку. Оболочечные вирусы, не содержащие нейраминидазу, такие, например, как вирус везикулярного стоматита, содержат в мембране ганглеозиды, сходные с ганглеозидами клеточных мембран (Klenk, Choppin, 1971).

Липиды, входящие в состав мембран вирусов гриппа и других оболочечных вирусов, явились предметом вышедших недавно обзоров '(Choppin et al., 1971; Blough, Tiffany, 1973; Klenk, 1973, 1974; Lenard, Compans, 1974; Choppin, Compans, 1975; Сотргпэ, Choppin, 1975).

Д. УГЛЕВОДЫ

Кроме рибозы, входящей в состав вирусной РНК, приблизительно 5—8% массы вириона гриппа составляют углеводы (Frommhagen et al., 1959). Большая часть, если не все углеводы вириона, ковалентно присоединена к молекулам гликопротеидов или гликолипидов. В вирионе гриппа присутствуют галактоза, манноза, глюкоза-мин и фукоза, а состав Сахаров эквивалентен составу углеводного компонента мукопротеидов клетки-хозяина (Ada, Gottschalk, 1956). Изолированный HAi-гликопротеид гемагглютинина вируса гриппа штамма BEL, который предварительно (культивировали на куриных эмбрионах, содержал 9,4% N-ацетилглюкозамина и около 20% его общей массы составляли углеводы (Laver, 1971, 1973). Углеводы являются именно тем хозяйским антигеном, который был найден в составе очищенных вириояов (Knight, 1946; Smith et al., 1953) в ковалентно связанном с вирусным гликопротеидом виде (НагЬое, 1963; Laver, Webster, 1966; Lee et al., 1969). Из мембран инфицированных клеток (Laver, Webster, 1966) и из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов (Haukenes et al., 1965; Lee et al., 1969) был выделен углеводный компонент, который обладал антигенным родством с хозяйским антигеном очищенных вирионов. Антиген, выделенный из аллантоисной жидкости, являлся муко-полисахаридсульфатом, не содержащим уроновой или нейраминовой кислоты, и по своему составу принадлежал к классу кератосульфатов (Haukenes et al., 1965). Недавно было показано, что гликопротеиды вириона гриппа селективно метятся радиоактивным сульфатом, связывающимся, вероятно, с углеводной частью в виде эфира (Compans, Pinter, 1975). Кроме того, 'было обнаружено, что сульфат включается в компонент с большой относительной молекулярной массой, являющийся, вероятно, мукополисахаридом хозяйской клетки, который может быть тождествен хозяйскому клеточному антигену, ассоциированному с очищенным вирионом.

Включение радиоактивных предшественников глюкозами-на и фукозы в вирусные гликопротеиды НА и NA указывает на то, что углеводная часть этих молекул синтезируется уже после начала вирусной инфекции (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970). Синтезируются ли вновь или используются существовавшие ранее углеводы для построения вирусных гликолипидов — вопрос, который еще требует разрешения.

Существующие в настоящее время факты указывают на то, что последовательность и состав углеводных остатков в вирусных гликопротеидах и гликолипидах определяются клеткой-хозяином. В дополнение к указанным «хозяйским» антигенным свойствам углеводного компонента различие в электрофоретической подвижности гликопротеидов вирионов гриппа, выращенных на различных клеточных культурах, указывает на то, что какое-то количество сахарных остатков, включенных в молекулы гликопротеидов, может иметь клеточное происхождение (Haslam et al., 1970a; Compans et al., 1970a; Schulze, 1970). Для синтеза углеводных цепочек гликопротеидов необходимо по крайней мере четыре типа специфических трансфераз и, вероятно, сама вирусная частица не содержит достаточного количества генетической информации для кодирования синтеза этих ферментов. Гликозидирование полипептида НА, вероятно, происходит на мембранах эндо-плазматического ретикулума по механизму, сходному с механизмом синтеза углеводов Клеточных гликопротеидов (Compans, 1973b; Hay, 1974).

Остатки нейраминовой кислоты не содержатся в вирионах гриппа, вероятно, потому, что в них присутствует нейраминидаза (Klenk, Choppin, 1970; Klenk et al., 1970a, b; Palese, et al., 1974). Вирионы парагриппа, в состав (Которых также входят нейраминидаза, не содержат в тликопротеидах и глико-липидах остатков нейраминовой кислоты (Klenk, Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970a, b). В то же время в состав оболо-чечных вирусов других типов, не 'содержащих нейраминида-зы, входят остатки нейраминовой кислоты. Нейраминидаза, вероятно, необходима тем оболочечным вирусам, которые прикрепляются к рецепторам, содержащим нейраминовую кислоту. Этот вопрос будет подробнее освещен в гл. 3. В «летках, зараженных температурочувствительным мутантом, лишенным нейраминидазы, синтезируются вирусные частицы, содержащие остатки нейраминовой кислоты и образующие большие по размерам агрегаты на поверхности клетки (Palese et al., 1974). Процесс агрегации может быть подавлен добавлением нейраминидазы. Эти факты указывают на то, что нейраминовая кислота, содержащаяся в составе ви-риона, может служить рецептором для гемагглютининов других вирусных частиц, а это должно способствовать агрегации и низкому выходу инфекционных частиц. Таким образом, отсутствие остатков нейраминовой кислоты в вирионах гриппа и парагриппа является вирусспецифической модификацией вирусных углеводов; этот .процесс необходим для нормального высвобождения вируса из инфицированной «летки.

В присутствии модифицированного метаболита 2-дезо,кси-D-глюкозы или высоких концентраций глюкозамина интиби-руется процесс гликозидирования вирусных гликопротеидов и в инфицированных клетках обнаруживается негликозиди-рованный или гликозидированный частично полипептид — предшественник НА (Klenk et al., 1972b; Gandhi et al., 1972). Дефектные гликопротеиды, синтезируемые в присутствии указанных выше ингибиторов, обнаруживаются на гладких и грубых мембранах эндоплазматического ретикулума и включаются в состав вновь синтезируемых вирусных частиц (Klenk et al., 1974; Compans et al., 1974). Эти вирусные частицы обладали пониженной инфекционностью и гемагглюти-нирующей активностью. Таким образом, наличие нормального углеводного компонента, вероятно, не является необходимым условием ассоциации гликопротеидов с цитоплазматиче-скими мембранами. Однако, поскольку в этом случае имеет место снижение выхода зрелых вирионов, можно заключить, что процесс гликозидирования, вероятно, необходим для реализации полной 'биологической активности 'вириона.

Hi. МОРФОЛОГИЯ И ВЗАИМОСВЯЗЬ

КОМПОНЕНТОВ В ВИРИОНЕ

А. РАЗМЕР И ФОРМА

Ранние исследования вируса гриппа с помощью методов ультрафильтрации и электронной микроскопии показали, что вирионы гриппа имеют форму, близкую к сферической, со средним диаметром 80—120 нм (Elford et al., 1936; Taylor et al., 1943). С помощью негативного контрастирования вирионов гриппа было обнаружено, что поверхность вирусных частиц покрыта близко расположенными друг к другу выступами, ворсинками длиной 10—12 нм и что нуклеокапсид, заключенный внутри вирусной оболочки, имеет спиральную симметрию (Home et al., 1960; Hoyle et al., 1961). Метод негативного контрастирования позволил, кроме того, обнаружить гетерогенность и плеоморфизм популяции вирионов гриппа. Плеоморфизм, однако, обусловлен в основном методом выделения и очистки и может быть сведен к минимуму с помощью фиксации вирионов перед контрастированием (Choppin et al., 1961). На 4 и 5 показаны вирионы гриппа после их негативного контрастирования.

Хотя большинство лабораторных штаммов вируса гриппа имеет форму вирионов, близкую к сферической, оттененные напылением препараты штамма Япония/305 вируса гриппа А имели слегка вытянутую, бактериоподобную форму вирусных частиц (Choppin et al., 1960), а при наблюдении с помощью метода ультратонких срезов вновь образующихся вирионов гриппа было показано, что они имеют слегка вытянутую форму (6) (Compans, Dimmock, 1969; Bachi et al., 1969; Compans et al., 1970b). Нуклеокапсид вирусных частиц г, ультратонком срезе выглядит как нити с более высокой электронной плотностью, ориентированные параллельно длинной оси частицы, а оболочка представляет собой мембрану го слоем выступов на внешней поверхности (см. 5—8).

Кроме обычно наблюдаемых частиц, форма которых близка к сферической или слегка вытянутой, в препаратах вируса гриппа иногда обнаруживаются филаментозные формы. Филаментозные вирионы покрыты поверхностными выступами и имеют диаметр, характерный для сферических вирионов, т. е. 80—100 нм, но их длина может быть очень велика — 4 мкм (Mosely, Wickoff, 1946; Chu et al., 1949; Choppin et al., 1960, 1961). На 5 показан филаментозный вирион гриппа при его негативном контрастировании. Наличие филаментозных форм характерно для вновь выделенных штаммов (Chu et al., 1949; Choppin et al., 1960). Возможно, что филаментозные формы также преобладают при инфекциях верхних дыхательных путей человека, поскольку при первом пассаже на куриных эмбрионах вирусная популяция содержит большое число филаментов, в то время как -после нескольких пассажей в популяции обнаруживаются преимущественно сферические частицы (Choppin et al., 1960). Маловероятно, что первый пассаж на куриных эмбрионах приводит к селекции филаментозных частиц из преимущественно сферической популяции вирусов при инфекции у человека, а затем, при последующих пассажах на куриных эмбрионах, вновь отбираются сферические формы. Однако природа морфологии вирионов, продуцируемых при заболеваниях человека, будет установлена лишь после исследования достаточно большого числа вирусных популяций, выделенных непосредственно у человека. Была определена удельная инфекционность филаментозных форм. Она оказалась выше, чем удельная инфекционность сферических вирусных частиц. Филаментозные вирионы содержали больше РНК в расчете на один вирион, чем сферические (Ada et al., 1958).

Способность IK репродукции филаментозных форм является генетическим признаком, который может быть утрачен или приобретен в процессе рекомбинации (Kilbourne, Murphy, 1960; Kilbourne, 1963; Choppin, 1963). Рекомбинация между штаммами АО, для которых характерны сферические частицы, с филаментозными штаммами А2 приводила к возникновению сферических частиц с признаками штамма А2 и вирионов высокофиламентозного штамма АО. Таким образом, признак филаментозности может использоваться в качестве маркера в генетических исследованиях. Также генетически обусловленные вариации морфологии вирионов указывают на различие в структурной организации или в скорости синтеза белков вирусной оболочки, вероятно М-белка. Предварительные исследования сферических и филаментозных форм одного и того же штамма не выявили различий в суммарном белковом составе (Choppin, неопубликованные данные), однако для полного выяснения этого вопроса требуется более детальное изучение.

Было показано, что поверхностно-активные вещества, такие, как алкоголят витамина А, индуцируют образование филаментозных и высокоплеоморфных частиц в штаммах, для которых в обычных условиях характерна продукция сферических частиц (Blough, 1963). Хотя эти наблюдения и указывают на то, что форма вирионов может зависеть от присутствия такого рода соединений, они не противоречат данным, которые интерпретируются с учетом генетического контроля за образованием филаментозных форм при отсутствии поверхностно-активных веществ.

При исследовании вирионов гриппа с помощью методики лиофильного высушивания и методики «фризэйтчинг» (Nermut, Frank, 1971) наблюдали высокую степень однородности популяции вирионов. Некоторые из частиц давали тени, характерные для правильных многогранников, и на этом основании был сделан вывод, что вирионы гриппа могут иметь икосаэдрическую симметрию. Наблюдались также упорядоченные гексагональные образования на поверхности вирионов (Almeida, Waterson, 1957; Archetti et al., 1967; Nermut, Frank, 1971), а в случае вирионов гриппа С была обнаружена гексагональная решетка, выстилающая внутреннюю сторону поверхности вириона (Waterson et al., 1963; Flewett, Apostolov, 1967). Было предположено, что М-белок вируса гриппа образует икосаэдрическую оболочку под двойным липидным слоем и таким образом выступает в качестве своего рода капсида вируса (Schulze, 1973). Однако более поздние эксперименты не подтвердили наличия у вирионов икосаэдрической симметрии, и, действительно, имеются веские причины в пользу того, что такая симметрия для вирионов гриппа маловероятна. Хотя и имеются другие примеры вирионов с икосаэдрической симметрией, которые могут существовать либо в виде длинных трубчатых структур, либо в виде икосаэдров, сферические вирионы гриппа имеют размеры, лежащие в широких пределах, а до сих пор нет прецедента, когда идентичные субъединицы образовали бы икосаэдрические календы с непрерывным набором размеров. Большинство наблюдаемых вирионов не имеет контуров, характерных для икосаэдрической симметрии, а наблюдаемые иногда угловатые очертания могут быть результатом деформации. Таким образом, для убедительного доказательства наличия у вирусной оболочки икосаэдрической симметрии требуются дополнительные аргументы.

Б. ПОВЕРХНОСТНЫЕ «ШИПЫ»

Поскольку вопросу о строении гемагглютинина и нейраминидазы будут посвящены гл. 3 и 10, здесь мы коротко коснемся этой проблемы.