III. Субстраты для нейраминидазы

А. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ N-АЦЕТИЛНЕЙРАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Метод, который обычно используют при определении концентрации нейраминовой .кислоты, включает образование окрашенного соединения при добавлении тиобарбитуровой кислоты. Он был разработан Warren (1959, 1963) и модифицирован Aminoff (1959, 1961). Метод позволяет измерять концентрацию свободной «ейраминовой кислоты в присутствии связанной ацетилнейраминовой кислоты. Если выход окрашенного продукта при определении концентрации N-ацетил-нейра-миновой кислоты принять за 100%, то его выход при проведении реакции с производными нейраминовой кислоты будет составлять: для N-гл'Иколилнейраминовой кислоты — 63%, М-ацетил-4-0-а|цетилнейрам|Иновой кислоты—100%, N-ацетил-8-О-ацетилнейрам'ИНовой кислоты — 47% и N-ацетил-7-О-ацетилнейраминовой кислоты — 0% (Drzeniek, 1972).

Б. ПРИРОДНЫЕ СУБСТРАТЫ

Нейраминидаза уникальна по своей способности взаимодействовать с субстратами самых различных размеров (Ci-nader, 1967) —от сиалиллактозы с относительной молекулярной массой (ОММ) 633 до овомукоида (ОММ 44 000) и от фетуина (ОММ 48400) до чгдикопротеида, выделенного из мочи (ОММ 7-Ю6).

Все субстраты можно разбить иа две группы — высокомолекулярные и низкомолекулярные. Низкомолекулярные природные субстраты охарактеризованы полнее и, вероятно, ограничиваются лишь одним примером: N-ацетилнейраминилла'ктозой

или сиалиллактозой (17). N-ацетилнейраминиллактозу впервые изолировали из молозива крупного рогатого скота (Kuhn, Brossmer, 1958). Она содержала около 8—14% а, 2—>~6) связей и около 72% связей типа (а, 2—>-3) (Sehneir, Rafelson, 1966; Ohman, Hygstedt, 1968). Молекулы со связью типа (л, 2—хб) могут быть отделены от молекул со связью (а,2—>-3) с помощью ионообменной хроматографии по методу, описанному Sehneir и Ralelson (1966). В идеальном случае в качестве субстрата для нейраминидазы вируса гриппа должна быть использована N-ацетилнейраминиллактоза типа (а, 2—>-3), однако обычно для этой цели используют смесь изомеров двух типов. В качестве субстрата для нейраминидазы, «роме того, используют низкомолекулярные синтетические соединения, свойства которых будут описаны далее.

В природе существует много высокомолекулярных соединений, содержащих сиаловые кислоты. При определении пригодности субстрата для проведения количественного определения нейраминидазы вируса гриппа необходимо знать гомогенность и чистоту субстрата. Имеет значение тип сиа-ловой кислоты (например, N-ацетил-, N-гликозил- или O.N-диацетилнейраминовая кислота), содержащейся в субстрате. Пригодность вещества для работы с вирусными нейрамини-дазами определяется также тем, какой вид связи: '(а, 2—>-3), (а, 2—>-8) или (а, 2—*8) существует между нейраминовой кислотой и агликоном. Ранее в качестве субстратов использовали большое число гликопротеидов, содержащих опаловую кислоту, но только немногие из них были охарактеризованы с биохимической точки зрения.

Фетуин, аг-гликопротеид эмбриональной сыворотки теленка, является наиболее распространенным субстратом, впервые использованным в тестах на вирусную нейраминидазу. Spiro (1960) выделил фетуин из эмбриональной сыворотки теленка с выходом 17% от общего содержания белков сыворотки. Сиаловая кислота составляет 8,7% общей массы полипептида, относительная молекулярная масса которого

равна 48 400. Сиаловая кислота находится в основном в N-ацетильной форме с содержанием N-гликолилнейрамино-вой кислоты 7% от общего количества сиаловой .кислоты. Условия для определения иейраминидазы с использованием фе-туина в качестве субстрата были стандартизированы для об-наоужения нейраминидазных антител (Aymard-Henry et al., 1973).

В качестве нейраминидазного субстрата часто используют также муцины из подчелюстных желез. Содержание N-гли-колил- или N-ацетилнейраминовой .кислоты (варьирует в зависимости от источника выделения муцина (Gottschalk et al., 1972). Например, муцин, выделенный из подчелюстной железы овцы, содержит в основном N-ацетилнейраминовую -кислоту, в состав муцина, выделенного из подчелюстной железы свиньи, входит преимущественно N-гликолилнейраминовая кислота, а в состав бычьего муцина входит как N-глнколил, так и N-ацетилнейраминовая .кислота. Поскольку нейрами-нидаза вируса гриппа расщепляет N-ацетильную форму нейр-аминовой кислоты с большей эффективностью, чем N-глико-лильную форму (см. раздел II), лучшим субстратом можно считать муцин, выделенный из подчелюстных желез овцы. Мукоид ласточек (рода Collocalia), выделенный из съедобных птичьих гнезд, предложили в качестве субстрата для нейраминидазы Howe и соавт. (1961). Нейраминовая кислота составляет приблизительно 9—13% массы мукоида. Однако большое число ацетогрупп нейраминовой кислоты присутствует в нем не в N-ацетильной, а в О-ацетильной форме (Ка-than, Weeks, 1969). В качестве субстрата для нейраминидазы вируса гриппа использовали также орозомукоид—си-кислый гликопротеид сыворотки человека (Rafelson et al., 1963a).

При сравнении скоростей отщепления N-ацетилнейраминовой кислоты от некоторых (высокомолекулярных субстратов Rafelson и соавт. (1963а) определили, что если принять количество NANA, отщепляемого от сиалиллактозы, за 100%, то от мукоида Collocalia отщепилось 26%, от гаптоглобина 1-1—23%, от гаптоглобина 2-2 — 22%, от орозомукоида — 17%, от ингибитора, изолированного из стром эритроцитов,— 10%, от гликопротеида мочи — 5% N-ацетилнейраминовой кислоты. Однако, хотя и имеется большое различие в скоростях отщепления, абсолютное количество отщепляемой за достаточное время от указанных субстратов нейраминовой кислоты менялось в пределах 58—85%, если за 100% принять отщепление от сиалиллактозы.

Совсем мало известно о реальных субстратах, подверженных действию нейраминидазы во время репликации вируса гриппа in vivo. Известно, что нейряминидаза отщепляет нейраминовую кислоту от поверхностного рецептора эритроцитов при элюции с них вирионов гриппа. Этот рецелторный

белок — гликопротеид с относительной молекулярной массой около 31000 — был выделен в чистом виде и обладал М- и N-группоспецифической активностью крови (Kathan, Winzler,. 1963; Winzler, 1972). Аналогичные гликопротеиды других клеточных мембран не были изучены так же подробно.

В. СИНТЕТИЧЕСКИЕ СУБСТРАТЫ

Большое 'количество синтетических субстратов для нейраминидазы было получено с помощью присоединения ароматических и алифатических спиртов к С2 углеродному атому различных производных нейраминовой .кислоты (Tuppy, Gottschalk, 1972). ЭТИ синтетические субстраты можно приготовить с высокой степенью чистоты. Они могут помочь в понимании механизма специфичности различных нейраминидаз. Meindl и Tuppy (1967) предложили использовать в качестве удобного кристаллического субстрата для нейраминидазы фенилкетозид N-ацетилнейраминовой кислоты: 2-фенил-^ ацетилнейраминовую кислоту. Отщепляемый в этом случае фенол определяли с помощью фенольной реакции Фолина. И. М. Привалова и А. Я- Хорлин (1969) описали синтез 2-р-нитрофенил-^ацетилнейраминовой кислоты, которую также можно использовать в качестве удобного субстрата для нейраминидазы. Подобный субстрат — 2-(О/-метоксифенил)-г\1-ацетилнейраминовая кислота (МФН) (Tuppy, Palese, 1969) можно успешно применять в качестве субстрата с использованием фенольной реакции Фолина (Palese et al., 1973). Другую методику использования МФН в качестве субстрата описали Sedmak и Grossberg (1973). После ферментативного отщепления МФН отщепленный 3-метоксифенол (МФ) определяют как солюбилизированный комплекс диазониевой соли с МФ. Белок в высокой концентрации мешает определению* свободного фенола по методу Фолина (Palese et al., 1973), но не играет роли в МФ-диазониевом методе (Sedmak, Gross-berg, 1973), что позволяет проводить определение нейрами-нидазной активности тотальных вирусных препаратов. МФН также использовали для обнаружения нейраминидазной активности в полиакриламидных гелях и целлюлозоацетатных пластинах (Tuppy, Palese, 1969; Bucher, Kjlbourne, 1972), а также для окраски бляшек вирусов, содержащих нейрами-нидазу (Palese et al., 1970, 1973). Для обнаружения вируса с помощью метода бляшек в монослой клеток вводят вирус гриппа или парагриппа, и на монослой наносят слой агара. После необходимой инкубации добавляют субстрат и диазо-ниевую соль 4-амино-2,5-диметоксинитразобензола, которые диффундируют сквозь агар. В местах репликации вируса субстрат гидролизуется и образует с диазониевой солью нерастворимый продукт красного цвета (18). Из этих фокусов может быть изолирован инфекционный вирус.

Недавно был синтезирован флюоресцирующий субстрат для нейраминидазы — 4-1метилилум'беллиферрил-Г\[-ацетил-нейраминовая кислота (Palese, неопубликованные данные). Субстрат позволяет -быстро и с высокой чувствительностью определить нейраминидазную активность. Разработка такого рода субстратов должна облегчить исследование по изучению свойств нейраминидазы, а также помочь в разработке методов ее выделения и количественного определения. Конфигурация этих субстратов может помочь в дальнейших исследованиях природы активного центра фермента.