3. Физические свойства информационной рнк (мРнк)

При изучении вкРНК, ассоциированной с полисомами (мРНК), обнаружено, что основное количество, если не вся мРНК, находится >в виде РНП. Полисомы изолировали, разрушали высокой концентрацией соли, ЭДТА и пуромицина (Blobel, 1971), и полученную таким образом мРНК подвергали анализу. Менее 2% вкРНК находилось в свободном виде, оставшиеся 98% составлял РНП. Большие предосторожности были приняты для того, чтобы убедиться, что полипептид NP (единственный яолипептид, ассоциированный с изолированной мРНК) неспецифически не адсорбируется на свободную мРНК в процессе самой изоляции. Трудно убедиться в том, что мРНП представляет собой «непрерывный» РНП, т. е. не имеет участков, свободных от белка, однако, основываясь на седикентационных характеристиках изолированного мРНП и его плавучей плотности в CsCl, можно сделать вывод, что, по-видимому, по своим физическим свойствам мРНП идентичен вирионному.

Большое число исследователей высказывали точку зрения, что мРНК млекопитающих существует и функционирует как иРНК в виде РНП (Spirin, Nemer, 1965; Spirin, 1966; Perry, Kelley, 1968; Henshaw, 1968; Kumar, Lindber, 1972; Bryan, Hayashi, 1973; Gross, 1968; Spirin, 1969). Ясно, что мРНП, будучи более устойчивым к расщепляющему действию РНК-аз, будет более стабилен, чем свободная мРНК. Однако не совсем ясно, как транслируется такая молекула. По-видимому, этот процесс должен включать диссоциацию субъединиц по-

липелтида с РНК в месте контакта рибосомы с мРНК. Возможно также, что полипептидная часть комплекса играет ре-гуляторную роль в процессе трансляции. Полное решение всех этих проблем будет возможно лишь при исследовании белоксинтезирующих систем.

VI. Действие ингибиторов на синтез рнк

Л. АКТИНОМИЦИН D

Ранее мы уже указывали (см. раздел1 VA, 1), что AD полностью ингибирует синтез вкРНК вне зависимости от того, на каком этапе репликативного цикла он вводится в систему, и лишь в малой степени подавляет синтез вРНК (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). По данным Gregoriades (1970), вкРНК, синтезированная до начала ингибирования ее синтеза, продолжает функционировать как иРНК в течение по крайней мере 17 ч после добавления AD. Как установлено в настоящее время, по-видимому, интерпретация данных была прямо противоположна у исследователей, стоящих на точке зрения, что AD вообще не обладает ингибиторными свойствами, если его добавляют спустя 2—3 ч после начала инфекции (Barry et al., 1962; Barry, 1964; Granoff, Kingsbury, 1964), и тех, кто считает AD способным обладать ингибитор-ным эффектом при добавлении его в любое время (Pons, 1967b; Scholtissek, Rott, 1970). Истина, вероятно, лежит где-то между этими двумя точками зрения. Актиномицин D ингибирует синтез вкРНК вне зависимости от момента появления его в клетке, в частности, если AD добавляют до момента, когда в клетке уже синтезировалось большое число молекул мРНК- Именно это является причиной снижения скорости синтеза вирусных полипептидов. Если же AD добавляют после того, как уже синтезировалось значительное количество молекул вкРНК, и этого количества достаточно для производства полипелтидных молекул и для того, чтобы на них, как на матрице, синтезировались молекулы вРНК, то синтез вирусных частиц будет проходить с нормальной скоростью.

Таким образом, начиная с этого момента, AD проявляет себя как безингибиторное вещество. Необходимо подчеркнуть, однако, что AD является ингибитором синтеза вкРНК и должен использоваться с осторожностью при изучении синтеза внутриклеточных макромолекул.

Природа ингибиторного действия AD на синтез IBKPHK В настоящее время неясна, поскольку AD эффективен при введении в «летку до начала инфекции. Вполне возможно, что AD подавляет какой-то клеточный механизм, необходимый для синтеза вкРНК. Это означает, что функциональная хозяйская ДНК, но не ее синтез (Burry, 1964), необходима для

репродукции вируса. AD не ингибирует синтез вкРНК in vitro (Chow, Simpson, 1971), во, как ни странно,, подавляет внутриклеточную транскрипцию (Bean, Simpson, 1973). Можно сделать вывод, что AD ингибирует синтез какого-то клеточного фактора (или факторов), необходимого для процесса транскрипции. Этот фактор отсутствует в системе in vitro, и, хотя некоторый синтез вкРНК и происходит, этот процесс может в значительной мере стимулироваться добавлением клеточного фактора (Rochovansky, персональное сообщение).

Работе по исследованию синтеза РНК вируса гриппа мешала невозможность провести эксперименты лульс-чейза на монослоях клеток куриных фибробластов; клетки продолжали включать меченый уридин даже в присутствии большого избытка немеченого нуклеинового основания. Недавно AD использовали для блокировки включения меченого уридина в вкРНК, ассоциированную с полисомами. Хотя это не 'был «чейз» в правильном значении этого слова, такая обработка позволила проследить судьбу предсуществующей вкРНК. Было показано, что после того, (как вкРНК 'была изолирована из инфицированных клеток после короткой пульсовой экспозиции (30 мин) меченым основанием, большая часть РНК седиментиро'вала в области 14S. При увеличении времени экспозиции коэффициент седиментации увеличивался, пока при экспозиции Р/г ч не достигал средней величины 18S и распределения, характерного для вРНК-

При обработке клеток пульсовой меткой в течение 30 мин и добавлении затем AD в разное время при отсутствии метки был показан некоторый сдвиг в распределении меченой РНК при ее скоростном седиментационном анализе. Непосредственно после действия метки приблизительно 70% меченой вкРНК наблюдали в области 9—15S и 30% —в области 15—• 22S (РНК, экстрагированная из вирионов, имела следующее распределение: 20% в области 9—15S и 80% в области 15— 22S). В конце 30-минутного периода экспозиции меткой изотоп убирали, добавляли AD и аликвоты суспензии клеток отбирали каждые 30 мин. После 60-минутной экспозиции с AD (при увеличении экспозиции дальнейших изменений не наблюдалось) метка распределялась следующим образом: 40% в области 9—15S и 60% в области 15—22S; эти величины находятся между величинами, характерными для вРНК и вкРНК в конце 30-минутного действия пульсовой метки. Важно то, что значительное увеличение включенной метки в 15— 22S РНК не обусловлено увеличением количества этой РНК, а связано с уменьшением количества 9—15S РНК- Эти результаты могут быть интерпретированы с учетом того, что AD, как и было ранее предположено, ингибирует синтез вкРНК. Однако уменьшение количества меньших по размерам фрагментов вкРНК может означать не то, что РНК яа-

ходятся в избыточном количестве, а скорее то, что имеет место наличие неполных молекул РНК большой молекулярной массы. При прекращении их синтеза с помощью AD эти находящиеся в состоянии роста молекулы диссоциируют с полисом, а в ассоциированном с полисомами состоянии остаются только закончившие свой синтез молекулы вкРНК, и они имеют то же относительное распределение по РНК-фрагментам, что и РНК, изолированная из вирионов.

Эти эксперименты были описаны здесь так -подробно для того, чтобы прояснить несколько важных для синтеза вкРНК фактов, ©o-первых, неравномерное распределение молекул вкРНК после относительно короткой пульсовой экспозиции меткой обусловлено скорее присутствием незакончивших свой синтез молекул РНК, а не избыточным содержанием малых по размерам молекул. Как уже было отмечено в разделе VA, 2, если редуллицирование вкРНК случайно и неконтролируемо, то можно обнаружить гораздо больше малых, чем больших, фрагментов РНК- Поскольку такал ситуация не наблюдается IB эксперименте, должен иметь место механизм контроля, определяющий количество синтезирующихся фрагментов данного размера. Во-вторых, поскольку были обнаружены неполностью закончившие свой синтез молекулы РНК (в виде РНП), ассоциированные с полисомами, либо транскрипция вкРНК происходит на цепочке субъединиц полипептида NP, либо этот белок ассоциирует с еще неполной цепью РНК- Этот механизм отличен от механизма, согласно которому сначала синтезируется полная молекула РНК, а затем она лротеинизируетея. Кроме того, в связи с тем что эти неполные молекулы отделяются от полисом, можно заключить, что трансляция вкРНК имеет место в то время, когда цепь еще синтезируется. Такая ситуация наблюдается в большинстве исследованных бактериальных систем.

Б. ЦИКЛОГЕКСИМИД

Циклогексимид ингибирует синтез белков за счет прекращения удлинения полипептидной цепи (Wettstein et al., 1964; Stanners, 1966; Watanabe et al., 1967). Обработка клеток, инфицированных вирусом гриппа, циклогексимидом снижает синтез вкРНК и полностью блокирует синтез вРНК (Pons, 1973). Эти результаты согласуются с результатами Scholtis-sek и Rott (1970), изучающих суммарные клеточные экстракты с помощью метода самогибридизации.

Природа ингибиторного эффекта циклогексимида еще неясна. Различная чувствительность синтеза вРНК и синтеза вкРНК к действию циклогексимида и AD указывает на то, что в синтезе принимают участие два различных фермента (или если не два фермента, то одна ферментная система с

различными субъединицами, которые могут быть представлены •поляпептвдами как клетки-хозяина, так и вирусспеци-фичеакими), синтез которых чувствителен к присутствию указанных ингибиторов.

В. КОРДИСЕПИН

Кордисепин, являясь ингибитором синтеза лоли-А последовательности (Penman et al., 1970; Darnell et al., 1971), может играть, как 'было установлено на большом числе вирусных и клеточных систем, важную роль IB синтезе функциональных информационных РНК- Клетки (CEF или ВНК-21) инфицировали вирусом гриппа, обрабатывали кордиселином в течение 45 мин в промежутке между 2 и 4 ч после начала инфекции, а затем метили [3Н]-уридином в течение 30 мин. Из клеток акстрагировали полисомы и РНП и сравнивали с полисомами и РНП необработанных инфицированных и контрольных клеток. В инфицированных клетках кордисепин вызывал 70% ингибирование включения метки как в полисо-мы, так и в РНП и 60% ингибирование титра гемаотлютина-ции и выхода инфекционного вируса. Включение метки в полисомы неинфицированных клеток CEF ингабировалось приблизительно на 80%. В клепках ВНК-21 кордисепин не влиял на титр гемагглютинации и инфекционность вируса, ингиби-ровал синтез полисом и РНП лишь в малой степени, однако ингибировал включение метки в полисомы неинфицированных клеток на 86% (Rochovansky, Pons, 1975).

По данным Etkin и Krug (1974), в мРНК вируса гриппа присутствуют лоли-А участки. Поскольку вРНК не содержит в своем составе комплементарных поли-У фрагментов (Marshall, Gallespie, 1972; Rochovansky, Pons, 1975), участок лоли-А, обнаруживаемый в молекуле вкРНК, должен присоединяться уже после окончания процесса транскрипции. Ясно, что клетки CEF, которые обладают относительно невысокой метаболической активностью, при наших условиях эксперимента [но которые более активны в системе Mahy и соавт. (1973), где кордисепин слабо влияет на продуцирование ви-рионов штамма FPV в клетках CEF] могут быть вынуждены синтезировать некоторые клеточные структуры, такие, как лоли-А, прежде чем продолжить вирусную репликацию. Клетки же ВНК-21 более активны в метаболическом отношении и поэтому могут содержать'более обширный резервуар компонентов клеток-хозяев, необходимых для синтеза вируса. Утверждение о том, что в некоторых случаях синтез клеток требуется для продукции вируса, подтверждается данными работы Mahy и соавт. (1972), в которой показано стимулирование синтеза вируса FPV в клетке CEF ДНК-зависимой РНК-полимеразой П. РНК-полимераза II является ферментом, участвующим в синтезе клеточной мРНК-