1. Анализ экстрагированной рнк с помощью градиентного центрифугирования

Скоростное градиентное центрифугирование является простейшим методом определения седиментационных параметров и получения основной информации о вирионных и вирусспецифических РНК- Рибонуклеиновую кислоту, полученную из вирионов, обработанных смесью фенол—хлороформ SDS, ресуспендируют после осаждения спиртом в буфере STE. РНК наслаивают на линейный (10—35%) глицериновый градиент (объем единичного градиента 17 мл) в 'буфере STE, содержащем 1 М мочевину (STEU-буфер). Нами было обнаружено, что, если покрыть центрифужные пробир-

ки тонким слоем силиконовой смазки, это улучшает разрешение и уменьшает влияние стенок во время центрифугирования. Глицерин используют при проведении 'большинства опытов (исключая опыты по изучению полисом), поскольку он имеет более низкую плотность, чем сахароза; в отличие от сахарозы может быть подвергнут автоклавнрованию для стерилизации и разрушения примесных РНК-аз; не замерзает при температуре —20 "С, а это решает ряд проблем, возникающих при замораживании биологического материала, и, наконец, глицерин является более слабым, чем сахароза, гасителем в большинстве сцинтилляционных жидкостей.

После прохождения вирусной РНК через глицериновый градиент при центрифугировании при 120 000 g в течение 17 ч фракции (по 1 мл) собирают, начиная от дна центрифужной пробирки, и определяют радиоактивность каждой фракции. Как видно из 27, с помощью этой методики РНК можно разделить на три класса с седиментационными коэффициентами приблизительно 18S, 14S и 11S. Если препа-

рат вируса не обработать во время очистки РНК-азой, обычно дополнительно наблюдаются четыре класса с коэффициентами седиментации в пределах 4—7S. Вероятно, материал с коэффициентом седиментации 7S представляет собой хозяйские и свободные вирионные РНК, адсорбированные на поверхности вириона.

2. Анализ экстрагированной рнк с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (паагэ)

Хотя анализ вирусной РНК с помощью ПААГЭ и является более сложным, чем ее исследование с помощью седиментации, он является более информативным методом. В основном до настоящего времени пользовались двумя системами гелей: агарозо-акриламидным с использованием в качестве сополимеризатора бисакриламида (Pons, Hirst, 1968a) и ак-риламидным гелем без агарозы с использованием в качестве' вещества, образующего поперечные молекулярные сшивки, этилелдиакрилата (Duesberg, 1968). Обе системы имеют свои преимущества и недостатки, однако детально мы опишем только первую систему. Наш опыт использования системы агароза — акриламид — бисакриламид позволяет утверждать, что для получения удовлетворительных результатов необходимо исключить несколько источников регулярных ошибок. Детальное описание самого метода приведено в работах Pons и Hirst (1968a), а также Pons (1972). К важным деталям эксперимента, о которых упоминалось ранее и которые были опущены в приведенных работах, относятся: необходимость получения гелей и проведение электрофореза в стеклянных трубках, покрытых силиконовым веществом, таким, как ди-метилдихлорсилан; необходимость покрывать гель слоем воды сразу же после смешения компонентов геля до возникновения полимеризации и, наконец, нежелательность введения ■в раствор анализируемой РНК стартового красителя. Стартовый краситель должен помещаться в отдельный гель, приготовленный аналогично гелю с анализируемой РНК.

На 28 представлена типичная электрофореграмма РН1-уридин-меченой вРНК, изолированный из в'ирионов.. Гельэлектрофорез днРНК, полученных из инфицированных клеток, показал присутствие шести различных по длине мо-текул РНК (см. 26) (Pons, Hirst, 1968). По данным Skehel (1971), с помощью ПААГЭ можно получить шесть различных молекул онРНК, если разрушать вирус с помощью' додецилсульфата лития. С другой стороны, Lewandowski и соавт. (1971), используя другой метод, основанный на определении числа З'-концов, оценили минимальное число фрагментов РНК в одном вярионе и получили число 7. Таким оо-разом, в настоящее время, вероятно, можно утверждать, что

геном вируса гриппа состоит из 6—7 индивидуальных молекул РНК1. Неопределенность в знании точного числа фрагментов, содержащихся в одной вирусной частице делает 'невозможным точное определение относительной молекулярной массы вирусного генома. Однако оценка, основанная на необходимом для синтеза вирусспецифических полипептидов количестве информации, позволяет утверждать, что вирусный

геном должен иметь молекулярную массу не ниже 3,5-106— 4- 10е. Lewandowski и соавт. (1971) определили, что суммарная молекулярная масса описанных им семи фрагментов РНК должна -быть не ниже 4,7-107.

Недавно мы применили новую систему для электрофореза с использованием вместо цилиндрических гелей плоских («слаб-гели»). Этот метод позволил показать, что геном вируса гриппа состоит из 8 отдельных кусков онРНК. При изоляции днРНК из инфицированных «слеток также наблюдалось 8 фрагментов днРНК. В обоих случаях фрагменты РНК группировались следующим образом: 3 больших фрагмента с -близкой молекулярной массой, 3 фрагмента с промежуточными размерами и с резко различающейся молекулярной массой и 2 малых по размерам фрагмента. Palese, используя аналогичный метод анализа онРНК, получил 9 фрагментов РНК (Palese, персональное сообщение). Присутствие 9-то и следующих по номеру фрагментов РНК (имеющих более низкую по сравнению с остальными фрагментами .молекулярную массу), вероятно, имеет отношение к множественности заражения.

Рибонуклеиновая кислота вируса гриппа может быть проанализирована с помощью МАК-1К0ЛОНОК по методу, описанному Mendall и Hershey (1960). В режиме градиентной элю-ции вРНК элюируется с таких колонок при 1 М NaCl (Pons, 1967а) в виде отдельного пика. Последующий анализ этой РНК при разделении с помощью скоростной седиментации показал, что РНК седиментирует в широкой области со средним коэффициентом седиментации 18S. Таким образом, использование МАК-колонок для исследования изолированной вРНК имеет ограниченные преимущества перед другими методами, однако эта методика крайне удобна при анализе РНК, выделенной из инфицированных .клеток. При хроматографии на МАК-колонке такой РНК, изолированной с помощью смеси фенол-SDS, происходит разделение вирусных онРНК и днРНК. Однонитчатая РНК элюируется вместе с 285-рибосомальной РНК клетки-хозяина. Если такую смесь РНК клетки-хозяина и вируса попытаться разделить с помощью скоростной седиментации, РНК (имеющая среднюю константу седиментации 18S) и 28S-PHK клетки-хозяина выйдут в разных фракциях. Этим методом можно получить относительно чистую вРИК, изолированную из .клетки.

Ш. ФИЗИЧЕСКИЕ И ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РНК ВИРУСА ГРИППА

А. РНК ИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА

В предыдущих разделах мы описали различные методы, которые были использованы для выделения и анализа вири-онной РНК. За исключением одной работы Li и Seto (1970), утверждавших, что 'РНК, изолированная из вирусных частиц, может быть получена в виде отдельной полимерной молекулы, видной в электронном микроскопе, все данные, описанные многочисленными авторами, указывают на то, что вирусная РНК фрагментирована. Как 'было указано выше, существует несколько мнений о точном числе фрагментов РНК, входящих в состав одной вирусной частицы. Это обстоятельство не позволяет определить относительную молекулярную массу вирусного генома с какой-либо степенью определенности.

Duesberg и Robinson (1967) определили ну-клеотидный состав вРНК, изолированной из штамма PR8: урацила 33%, цитозина 24%, аденина 23% и гуанина 19,5%." Ранее Ada и Perry (1956) обнаружили, что нуклеотидный состав вРНК, хотя и слабо, но определенно варьирует от штамма к штамму. Нуклеотидный состав вРНК, а также ее чувствительность к РНК-азе указывают на то, что она однонитчатая. Поскольку не наблюдается еамогабридизации между молекулами РНК, изолированными из вирпонов, онРНК в составе различных вирионов представлена цепочками одной полярности. (Scholtissek, Becht, 1971; Pons, 1971).

Важным свойством РНК вируса гриппа является ее фрагментарность. Вероятно, большое число биологических свойств вируса, которые отличают его от большинства других вирусов животных, могут 'быть объяснены на основании этого факта. Хотя некоторые вирусы растений, по-видимому, имеют фрагментарный геном, в настоящее 'время показано, что, .кроме вируса гриппа, фрагментированную РНК содержат только рео- и онкорнавирусы1. В настоящее время фрагментарность генома вирусов гриппа подтверждена физическими, химическими и биологическими методами.

Седиментационный анализ меченой РНК, экстрагированной из очищенных вирусных частиц, привел многих исследователей к независимому выводу о том, что эта РНК имеет относительную молекулярную массу, слишком малую для 'кодирования информации, необходимой для синтеза вирус-специфических полипептидов (Davis, Barry, 1966; Duesberg, Robinson, 1967; Nayak, 1969; Pons, 1967a). В двух последних работах была описана изоляция РНК с высокой молекулярной массой (Agrawal, Bruening, 1966), однако, как сейчас ясно, полученные результаты, вероятно, связаны с агрегацией фрагментов РНК или с наличием неполностью депротеини-знрованных молекул РНП. Анализ вРНК, проведенный Duesberg (1968), Pons и Hirst (1968а) с помощью ПААГЭ, показал, что геном вируса представляет собой сумму по крайней мере пяти фрагментов РНК. Позже было обнаружено, что вирусспецифические донРНК, экстрагированные из инфицированных клеток, также представляют собой смесь фрагментов, которые после разделения на онРНК при плавлении имели те же электрофоретичесше подвижности, что и РНК, выделенные из вирионов (Pons, Hirst, 1968). Эти факты подтвердили точку зрения, что наличие фрагментов имеет биологическое значение и не связано с простыми деградационными процессами во время выделения РНК-

Приведенные биохимические эксперименты показали, что вирусный геном фрагментарен. Существует также несколько биологических фактов в пользу этого вывода. Высокая частота рекомбинаций, полученная при генетических скрещиваниях вирусов гриппа, указывает на наличие механизма, сходного со случайной пересортировкой сегментов, а не на процесс классической генетической рекомбинации с кроссинговерам между отдельными видами РНК (Simpson, Hirst, 1961; Hirst, 1962). Scholtissek и Rott (1969) обнаружили, что байер-139 (Вауег-139) инактивирует свойства вируса ступенчатым образом. Это указывает на наличие у вируса мультикомпонент-ного гнома. Опыты по множественной реактивации (Hend, Liu, 1951; Barry, 1961) и ультрафиолетовой инактивации (Joss et al., 1969; Gandi, Burke, 1970) были также интерпретированы как возможное доказательство существования мультикомпонентного генома.

Хотя данные биохимических и .биологических исследований наводили на мысль о существовании фрагментарного генома, наиболее доказательными экспериментами в пользу этого предположения были следующие: Young и Content (1971) разделили с помощью скоростной седиментации в РНК на фрагменты трех размеров. Каждый из трех классов фрагментов обладал собственным 5' концом вида рррАр. Le-wandowski и соавт. (1971) показали, что да З'-конце находится нефосфорилированный уридин (У-ОН). 'Кроме того, Content и Duesberg (1971) обнаружили разницу в последовательности оснований у трех различных по размерам классов вРНК, a Horst и соавт. (1972) показали наличие разных олигонуклеотидов в каждом из названных фрагментов РНК. Эти данные, при учете описанных ранее, позволяют сделать вывод, что крайне маловероятно, или даже невозможно, возникновение фрагментов РНК за счет расщепления одной ко-валентно непрерывной однонитчатой молекулы РНК

Таким образом, ясно, что геном вируса гриппа фрагмен-тирован. Однако нет каких-либо доказательств в пользу того, что имеет место связь между отдельными фрагментами, такая, например, как перекрывание комплементарных (концов. Поскольку вируоспецифическая РНК, -изолированная из инфицированных клеток, также фрагментирована, не совсем ясно, каким образом при созревании вируса в его состав включается нужное число нужных фрагментов РНК. Этот вопрос будет обсужден в разделе V этой главы.

Б. РНК, ИЗОЛИРОВАННАЯ ИЗ НЕПОЛНОГО (ФОН-МАГНУСОВСКОГО) ВИРУСА

Одна из особенностей вируса гриппа состоит в том, что при последовательных пассажах на куриных эмбрионах или клеточных культурах при высокой множественности заражения продуцируется сниженное количество инфекционного вируса при сохранении высокого титра гемагглютинации. Этот вирус с низкой инфекционностыо и высокой гемагглютиниру-ющей активностью называется неполным, или вирусом фон-Магнуса (von Magnus, 1954). Duesberg (1968) с помощью метода ПААГЭ обнаружил, что неполный вирус имеет сниженное содержание фрагментов РНК с большой молекулярной массой. Pons и Hirst (1969) показали, что после двух пассажей с высокой множественностью заражения в неполном вирусе резко снижается содержание только самого большого по размерам фрагмента РНК, в то время как лоллпептидный состав его меняется лишь количественно. Необходимо отметить, что хотя мы упомянули об этом самом большом по молекулярной массе фрагменте как об «утерянном» в процессе формирования неполного вируса, нельзя исключить возможность его присутствия во фрагментированном виде. Это может произойти, если РНК расщепляется в одной или большем количестве точек цепи. РНК в этом случае будет присутствовать в вирионе, но будет мигрировать в полпак-риламидном геле в новом месте, а это может привести к заключению об отсутствии фрагмента в вирусном препарате. Однако в настоящее время нет экспериментального доказательства этой точки зрения.

Choppin (1969) обнаружил, что несколько последовательных пассажей вируса гриппа штамма WSN с высокой множественностью заражения на клетках MDBK не приводят к образованию заметных количеств неполного вируса. С другой стороны, один пассаж этого вируса на клетках HeLa приводит к продукции неинфекционных НА-частиц (Henle et al., 1955; Hillis et al., 1960; White et al., 1965; Ter Meulen, Love, 1967). Choppin и Pons (1970) исследовали РНК вирусов, выращенных на клетках MDBK и HeLa, и обнаружили,,

что для вируса, выращенного на клетках MDBK, наблюдалось лишь небольшое снижение количества самого большого по размерам фрагмента РНК, и только после четырех последовательных пассажей с высокой множественностью заражения его количество снижалось в значительной степени (в отличие от двух пассажей на куриных эмбрионах и монослоях клеток CEF). В клетках HeLa одного пассажа вируса, культивированного ранее на .куриных эмбрионах, было достаточно для элиминирования самого 'высокомолекулярного фрагмента РНК. Larner и Hodge (1969) определили, что в клетках HeLa, инфицированных вирусом гриппа штамма PR8, синтезируются все семь фрагментов днРНК. Однако эти авторы не анализировали состав онРНК неполных вирусных частиц.

Описанные результаты указывают на то, что клетка-хозяин играет значительную роль в репликации вирусной РНК, хотя природа этого влияния еще неизвестна. Неясен также механизм, согласно которому отдельный фрагмент РНК элиминируется из вириона, хотя и было предложено следующее объяснение этого явления (Choppin, Pons, 1970). Поскольку репликация меньших по относительной молекулярной массе фрагментов РНК заканчивается раньше, чем репликация больших фрагментов (Mills et al., 1967; Spigelman et al., 1968), избыточное количество частиц вируса гриппа в клетке может привести к истощению пула нуклеотидов или другого химического соединения (других химических соединений), необходимого для синтеза больших по размерам молекул РНК- Эта гипотеза о конкурентной репликации малых фрагментов РНК исходит из предположения о независимости синтеза каждого отдельного фрагмента от синтеза других фрагментов, а также из случайного процесса упаковки фрагментов РНК в вирион (Compans et al., 1970). С тех пор как эта гипотеза была сформулирована, Bishop и соавт. (1972) показали, что каждый фрагмент РНК несет на себе свою собственную молекулу полимеразы. Это явилось аргументом в пользу описанного механизма.