IV. Синтез вирусных белков

А. ТРАНСЛЯЦИЯ В СИСТЕМЕ IN VITRO

Проблема РНК какого типа—вир ионного или комплементарного — является 'информационной для синтеза вирусных белков, пока не решена. Были получены противоречивые результаты относительно вида вируеспецифической РНК, связанной с полисомами. Nayak (1970) обнаружил в поли-сомной области сахарозного градиента, главным образом вРНК, в то время как Pons (1972) выделил из полисам исключительно вкРНК. Последнее было подтверждено наблюдением, что после добавления через 2 ч после заражения актиномицина D, который предпочтительно воздействует на синтез вкРНК (см. раздел III, В, 1), в полисомах зараженных клеток вкРНК не обнаруживается (Pons, 1973).

Используя 'белоксинтезирующую систему из Е. coli и вРНК вируса гриппа как матрицу, Siegert и соавт. (1973) обнаружили образование вирусного NP-белка в условиях in vitro. Этот меченый NP-белок -был охарактеризован методом преципитации в геле по тесту Ouchterlony. В противоположность этому Kingsbury :и Webster (1973) не наблюдали никакого вирусного белкового синтеза с вРНК, использовав бе-локсинтезирующую систему, полученную из ретикулоцитов кролика. В этой же системе, однако, они выявили синтез вирусного М-белка (ом. гл. 2) на матрице РНК, изолированной из зараженных клеток. Таким образом, в настоящий момент нельзя ответить на вопрос, только ли вириопная или только комплементарная, или некоторые фрагменты РНК одного типа и некоторые фрагменты РНК другого типа используются как матрицы для синтеза белков. Следовательно, пока к вирусам гриппа трудно применять определение «отрицательная» или «положительная» вирусная цепь, как это предложено Baltimore (1971).

Б. СИНТЕЗ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ IN VIVO

Изучению синтеза вирусных 'белков 'благоприятствует то, что в зараженной клетке синтез полипептидов клетки замещается вирусспецифическим синтезом. В клетках фибробла-стов Куриного эмбриона, зараженных ВЧП (Joss et al., 1969; Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973), и в клетках BHK 2IF зараженных ■ штаммом WSN вируса гриппа (Lasarowitz et al., 1971), к 4-му часу после инфекции синтезируются почти

только одни вирусные белки (31). Несколько ранее исследователи в зараженных клешах наблюдали синтез трех или четырех полипептидов (Taylor et al., 1969; Joss et al.,. 1969; Holland, Kiehn, 1970; White et al., 1970). Впоследствии были обнаружены и другие полипептиды (Lazorowitz et al.,. 1971; Skehel, 1972; Klenk et al., 1972b; Krug, Etkind, 1973). В целом в зараженных клетках были обнаружены все структурные -белки: один или два Р-белка, субъединица нуклеокап-оида NP, мембранный белок М, гемагтлютинияовый глико-протеин в нерасщепленной (НА) и расщепленной (НА1 и НА2) формах и субъединица NA.

Кроме вирионных 'белков, были описаны один или два неструктурных белка (NS).

Имеются заметные различия <в уровнях синтеза отдельных вирусных полипептидов. NP- и NS-полипептиды обычно первыми обнаруживаются в зараженных «летках. Skehel (1973) предположил, что полипептиды Р2, NP и NS, которые первыми обнаруживаются в «клетках, зараженных ВЧП, являются

продуктами фрагментов РНК, образуемых при селективной транскрипции вирионной полимеразой трех фрагментов вирусного генома. Когда «летки заражали в присутствии цик-.логексимида и пульсовую метку добавляли после удаления антибиотика, обнаруживались только три эти полипептида. На основании этого предположили, что молекулы РНК для этих .компонентов образовались с помощью вводимой вирионной лолимеразы в процессе первичной транскрипции. С 4-го по 6-й час после заражения куриных фибробластов ВЧП увеличивается уровень синтеза М-белка, а синтез NS-лолилепти-да уменьшается (Skehel, 1972, 1973). Таким образом, уровни синтеза иолипептидов могут индивидуально контролироваться и могут варьировать в течение цикла роста.

Кроме расщепления .полипептида НА на НА1 и НА2, нет данных о том, что вирусспецифические полипептиды вируса гриппа получаются в результате расщепления крупных предшественников (Taylor et al., 1969; Lazarowitz et al., 1971, Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973).

Недавно была получена новая информация о локализации вирусных компонентов в зараженных клетках при использовании авторадиографии (Becht, 1971) или методов фракционирования клетки и электрофореза в геле (Taylor et al., 1969, 1970). Согласно этим исследованиям, синтезы всех вирусных ■белков осуществляются, по-видимому, в цитоплазме. Предыдущие исследования локализации нуклеолротеинового антигена методом иммунофлюоресценции интерпретировали как указывающие на то, что синтез осуществляется в ядре с последующим выходом антигена в цитоплазму (Liu, 1955; Brei-tenfeld, Schafer, 1957; Holtermann et al., 1960). Однако ясно, что иммунофлюоресценция определяет накопление антигена, .а не его синтез (см. раздел IV, Б, 2).

1. РНК-полимераза

Вирус-специфическая активность РНК-зависимой РНК-по-лимеразы может быть обнаружена в клетках, зараженных вирусом гриппа, между 13Д и 3 ч после инфекции в зависимости от использованной системы клеток (Scholtissek, Rott, 1969а; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970). Это первая выявляемая вирусспецифичеокая активность после заражения. Большая часть вирусной активности лолимеразы выявляется в микросомальной фракции; некоторая же часть этой активности остается в ядрах и не может ■быть удалена оттуда даже интенсивным их промыванием. Фундаментальные отличия в кинетике проявления или в необходимых кофакторах между ядерным и микросомальным ферментами отсутствуют (Scholtissek, Rott, 1969a; Mahy et al., 1975).

При дальнейшем фракционировании цитоплазмы в ступенчатом сахарозном градиенте то методу Caliguiri и Tamm (1970) активность полимеразы обнаруживается в шероховатых мембранах (Compans, Caliguiri, 1973; Klenk et al., 1974a).

Поскольку активность вирусной полимеразы была обнаружена в очищенных вирусных частицах (см. гл. 5), возникает вопрос, с каким из вирусных 'белков она может быть ассоциирована. Полимераза, 'выделенная из клеток, зараженных вирусом гриппа, была очищена примерно в 200 раз. Единственным вирусспецифическим продуктом, ассоциированным с активностью полимеразы, был РНП-антиген (белок NP плюс вирусная вРНК, определенные то методу связывания комплемента). Все попытки удалить РНК из этого комплекса приводили к полной потере активности фермента (Schwarz, Scholtissek, 1973). Кандидатом на роль вирусной полимеразы был выдвинут Р-белок (Kilbourne et al., 1972). Когда ферментативный 'комплекс, меченный in vivo аминокислотами, выделяли из клеток, зараженных вирусом гриппа,, и очищали примерно в 35 раз, электрофоретический анализ выявил сначала в этом комплексе только ЫР-белоа< (Compans, Caliguiri, 1973). Впоследствии, однако, при других условиях введения ;метки удалось обнаружить и Р-белок (Caliguiri, Compans, 1974). С другой стороны, Klenk и соавт. (1974) обнаружили Р-белок в цитоплазматическом золе, 'который не обладает полимеразной активностью (Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969). Эти наблюдения могут означать, что Р-белок осуществляет свою (Предполагаемую активность ферментов только при связывании с РНП-антигеном.

То, что сам по себе РНП-антиген обладает полимеразной активностью, маловероятно, поскольку гипериммунная сыворотка против РНП-антигена не ингибнрует активности полимеразы, тогда как конвалесцентная сыворотка, которая может содержать антитела к полимер азе, ингибирует ее (Scholtissek et al., 1971). Такая конвалесцентная сыворотка (которая была получена из животных, перенесших инфекцию вирусам гриппа А) инги'бировала активность полимеразы всех изученных штаммов вируса гриппа А, но не подавляла активность полимеразы вируса гриппа В. Все эти наблюдения согласуются, с идеей о том, что РНП-антиген (BPHK + NP = = белок), может служить матрицей для синтеза вкРНК-