2. Агрегация и диссоциация моновалентного гемагглютинина

Как было указано, гемагглюти'нация имеется только при наличии мультивалентных молекул, которые могут быть сформированы in vitro в там случае, если НА2-часть субъединицы интактна. Такие агрегаты показаны на 34 (см. гл. 10). Поскольку они формируются из различного числа «шипов» НА*, агрегаты неодинаковы по размерам.

Процесс диссоциации «шипа» НА* и его агрегации с образованием частиц, вызывающих гемагглютинацию, представлены схематически на 14. «Шип» изображен как тример, причем гидрофобная область каждой из трех субъединиц НА* внедрена в двойной лилидный слой вирусной частицы. Эти гидрофобные области удаляются при изоляции НА* с помощью протеазы (см. 14,А).

Описанная модель основана на экспериментальных данных, полученных для (большого числа вирусных штаммов, однако не все детали схемы осуществляются для каждого отдельного штамма. Например, наблюдаются большие различия в чувствительности разных штаммов вируса к действию протеаз (Schulze, 1973). Протеазы инактивируют и, вероятно, разрушают НА* многих штаммов вируса (Kilbourne, 1969), однако в отношении некоторых из них имеет место протеазная инактивация, действующая не только исключительно яа НА*. Kilbourne и еоавт. показали, что НА-антиген может потерять чувствительность к лротеазе в процессе генетической рекомбинации (Kilbourne et al., 1972a). Эти наблюдения вместе с другими экспериментальными данными показывают, как опасно делать заключение о структурных перестройках на основе наблюдаемых изменений биологической активности. Действительно, описанная модель предполагает, что НА*, изолированный из вирусной частицы с помощью обработки (бромелайном, зде меняет своей структуры за исключением потери гидрофобной области. Однако такой НА*, изолированный из некоторых штаммов вируса, не адсорбируется на эритроцитах (Laver et al., 1974), что указывает на наличие структурных изменений в гидрофильной части субъединицы (в ее НАрчасти). Поскольку эти изменения -мотут быть крайне незначительными, их можно не заметить, если использовать имеющиеся в настоящее время физические методы.

IV. Функции гемагглютинина

Два важных аспекта, связанных с присутствием НА*, были ясны задолго до проведения детального анализа структуры вириона гриппа. После эпидемии гриппа в 1947 г. стало ясно, что поверхностные антигены вириона претерпевают кардинальные изменения своего состава и в связи с этим штаммы вирусов, обладающие одинаковым внутренним антигеном, показывают в перекрестных реакциях нейтрализации и подавления гемагглютинации низкую активность (Francis et al., 1947). Следовательно, было показано, что НА* является основным 'поверхностным антигеном и что он один стимулирует синтез антител, нейтрализующих инфекционность и ингиби-рующих темагглютинацию (Drzeniek et al., 1966; Laver, Kilbourne, 1966). Таким образом, был сделан вывод, что НА* ответствен за прикрепление вируса к клетке-хозяину или к эритроцитам и что изменения именно в его структуре влияют на антигенные свойства вирионов.

Как было показано в разделе III этой главы, некоторые из этих свойств остаются присущими НА* при его отделении от вирусной частицы. Изолированный НА* может адсорбироваться на эритроцитах и, если выполняются условия образования мультивалентных агрегатов, может вызвать гемагглю-тинацию. НА* вызывает образование HI и нейтрализующих

антител, если даже в качестве антигена используются обра

ботанные детергентом молекулы, не обладающие гемагглю-

тинирующей активностью. Эти антитела в очищенном виде

имеют высокую степень антигенной специфичности, так что

штаммовые различия, характерные для интактных вирибнов,

можно успешно исследовать при использовании субъединиц

в качестве антигенов. :

После выяснения структуры вириона гриппа стало также

понятно, почему очищенные вирионы содержат <в своем соста

ве так называемый антиген хозяина. Было 'выяснено, что этот

антиген, обнаруживаемый и в очищенных препаратах вируса

(Knight, 1944; Harboe et al., 1961; Harboe, 1963), является

углеводной частью поверхностных гликопротеидов. Он пред

ставлял собой гликопротеид, лишенный остатков еиаловых

кислот (Hankenes et al., 1966; Laver, Webster, 1966), реаги

ровал с антителами к НА* и блокировал их Ш-активность.

Эти кросс-реакции наблюдаются в связи с тем, что НА* содер

жит олигосахариды, синтезированные ферментами клетки-

хозяина из пула подходящих углеводных остатков, которые

поэтому сходны с олигосахаридами, содержащимися в гли-

копротеидах клетки-хозяина. . . . .

Информация, полученная при использовании в качестве объекта исследования изолированного НА*, была крайне полезна для выяснения структурных взаимоотношений внутри «шипа» НА* и в решении вопроса, какие части «шипа» способны связываться с лииидным двойным слоем, а какие — взаимодействуют с клеточными рецепторами. Однако понимание роли «шипа» НА* в присоединении вирионов к эритроцитам и к хозяйским клеткам возможно только при изучении НА* in 'situ. В связи с этим предпринимались попытки изменить НА*, входящий в состав вириона, для того, чтобы скор-релировать изменение в его структурной организации с изменениями в его свойствах.

16. Влияние присоединения остатков сиаловой кислоты на биологические свойства вируса гриппа. Очищенный вирус штамма A0/WSN инкубировали с ЦМФ-сиаловой кислотой и сиалилтрансферазой. Во время инкубации отбирали аликвоты для определения гемагглютинирующей и нейрами-нидазной активности и инфекционности. Нейрамииидазную активность определяли по скорости отщепления сиаловой кислоты от фетуииа с помощью колориметрического метода Aminoff (1961). Инфекциовность определяли методом подсчета бляшек в моноелюях клеток МДВК (Madin, Diarby, 1958) и фибропластов куриного эмбриона (CEF). Вирусные частицы с отщепленной с помощью трипсина нейраминидазой (ом. табл. 10) инкубировали в тех же условиях и их активность определяли тем же способом. Контроли, содержащие внтактный или трипсинизироваяный вирусы, инкубировали в той же среде за исключением ЦМФ-еваловой кислоты. После инкубации в течение 6 ч при 137 СС контроля обладали 100% гемагглютинирующей активностью и приблизительно 60 и 10% начальной инфекционности и нейраминидазной активности. 'Светлые значки относятся к трипеинизированном'у (вирусу (Schulze, 1975).

Довольно неожиданные биологические последствия .присоединения к гем агглютинину in vitro остатков сиаловой кислоты суммированы на 16. Гемагглютинирующая активность теряется, нейраминидазная активность остается той же, как для инкубированного (Контрольного вируса, а и-нфекцион-ность в значительной степени растет. Степень роста инфекционности зависит от количества присоединенной сиаловой кислоты, от клеток, на которых проводилось определение инфекционности, и от того, был ли вирус предварительно обработан трипсином для удаления его собственной NA*1.

Остатки сиаловой .кислоты, присоединенные ,к интактному вирусу in vitro, могут быть удалены с помощью NA* сиали-зидированных вирионов, если будут созданы оптимальные для работы этого фермента условия (Schulze, 1975a, b). В связи с этим вполне вероятно, что вирусная NA* отщепляет от вирионного НА* остатки сиаловой кислоты, присоединяемые к нему сиалилтраноферазами клетки-хозяина. Доказательства в пользу такого механизма были впервые приведены Palese и соавт. (1974) и будут описаны в гл. 4. Однако ковалентное присоединение сиаловой кислоты к вирусным гликолротеидам или к их предшественнику in vivo еще не было осуществлено.

Механизм увеличения инфекционности гари ковалентном присоединении сиаловой «кислоты [в настоящее время выясняется. Поскольку наблюдаемая степень увеличения инфекционности частично зависит от того, какой тип клеток используется для определения инфекционности, вполне вероятно, что присоединение остатков сиаловой кислоты увеличивает степень связывания вирионов с какими-то клеточными рецепторами. В этой связи интересно отметить, что, по предварительным данным, сиализидированные вирионы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, по-видимому, присоединяются ,к куриным эритроцитам так же, как контрольные вирионы (Schulze, неопубликованные данные). Эти результаты указывают на то, что при некоторых условиях гемагглю-тинация является неточным индикатором наличия взаимодействия вирионов с рецепторами эритроцитов, не говоря уже о взаимодействии их с рецепторами хозяйских клеток.

Аналогичные изменения активности могут быть вызваны с помощью обработки вируса гриппа фетуином — гликопро-теидом, содержащим остатки сиаловой кислоты (Der, Schulze, 1975). Контакт вирионов с фетуином приводит к потере ими гемагглютинирующей активности и увеличивает инфек-ционность препарата (табл. 11). Для предотвращения деструкции ингибитора вирусной нейрамияидазой вирусные образцы обрабатывали трипсином перед инкубацией с фетуином. Обработанные трипсином препараты, не обладающие нейраминидазной активностью, теряли гемаатлютинирующую активность и значительно .увеличивали свою инфекционность после инкубации с фетуином. Удаление остатков сиаловой кислоты с фетуином в большой степени снижало его стимулирующее действие и обработанный фетуин переставал быть ингибитором гемагглютинации. Это указывает на то, что

остатки сиаловой кислоты должны участвовать в изменении обеих активностей. Приведенные результаты показывают, что адсорбция вирионов на клетках-хозяевах может быть облегчена путем добавления некоторых водорастворимых глико-протеидов, содержащих в своем составе остатки сиаловой кислоты. Это увеличение инфекционности, так же как и в случае сиализидированных вирионов, может быть связано с образованием агрегатов, которые являются причиной инфекции, как это наблюдается при агрегатах неполных, но комплементационных вирусных частиц (Hirst, Pons, 1973). Независимо от того, какая из этих альтернатив в действительности имеет место, вероятно, настало время пересмотреть наши взгляды на роль сиалосодержащих гликопротеидов в инфекционном процессе, поскольку некоторые из этих молекул, по-видимому, стимулируют инфекцию вместо ее угнетения.

Вне зависимости от того, какой механизм ответствен за потерю гемагглютинирующей активности и увеличение инфекционности, приведенный выше экспериментальный материал подтверждает тот факт, что присоединение сиаловой кислоты к 1гемагглютинину или взаимодействие вируса с сиа-лосодержащими гликопротеидами приводит к возникновению инфекционных, но не агглютинирующих вирусных частиц. Инфекционные вирусные частицы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, наблюдались ранее в персистентно инфицированных культурах клеток (Gavrilov et al., 1972) в результате химиотерапевтической обработки мышей (Mag-rassi et al., 1966) и в процессе адаптации штаммов вирусов гриппа типа А2 к новым клеткам-хозяевам (Thibon et al., 1967). Поскольку ни в одном из этих случаев вирусные частицы не исследовали после их очистки, механизм ингибиро-вания гемагглютинации пока еще не ясен. Thibon и соавт.

(1967) предположили, что в их опытах гемапглютинин на поверхности вириона присутствовал, поскольку он вызывал синтез HI-антител, но был замаскирован. Ингибиторы же вируса гриппа типа А2 в культуральной среде не обнаруживались.