VI. Синтез липидов

Как и все вирусы, обладающие оболочкой, вирус гриппа приобретает свои липиды путем утилизации липидов клетки-хозяина. Это положение подтверждается следующими наблю-

дениями. Липидный состав вируса гриппа, как было установлено, -аналогичен таковому клетки-хозяина (Ambruster, Beiss, 1958; Frommhagen et al., 1959). Липиды клетки-хозяина, радиоактивно меченные -перед заражением, включаются в вирусные частицы (Wecker, 1957). При выращивании вируса в различных клетках-хозяевах выявляются модификации вирусных липидов (Kates et al., 1961, 1962). Вообще липиды вирусов, (которые ■отпочковываются от клеточной поверхности, близко отр!ажают липидный состав плазматической мембраны клетки-хозяина (Klenk, Choppin, 1969; 1970а, b; Renko-nen et al., 1971). Уровень синтеза de novo ф-осфолилидов в клетках фибро-бластов куриного эмбриона оставался неизменным в течение 7 ч после заражения вирусом гриппа; после этого весь синтез липидов был подавлен (Blough et al., 1973). Это подавление, вероятно, не является первичным эффектом, а может быть вторичным по отношению к инги-биро-ванию синтеза РНК или белка или к '.другим цнтолэтическим эффектам.

Таким образом, на основании результатов, полученных к настоящему времени, можно предположить, что синтез вирусных липидов осуществляется посредством нормальных клеточных процессов биосинтеза липидов, а вирусная оболочка формируется путем включения липидов из плазматической мембраны клетки-хозяина.

VII. Сборка (см. Также гл. 2)

А. ОБРАЗОВАНИЕ НУКЛЕОКАПСИДА

Как уже говорилось, наиболее вероятно, что белок нук-леокапсида синтезируется в цитоплазме. По-видимому, он присутствует там в течение короткого времени в свободной форме, а затем ассоциирует с вирусной РНК, образуя нук-леокапсиды (Klenk et al., 1974; Compans, Caliguiri, 1973). Поскольку NP-белок -быстро включается в яуклеокапсиды, РНК может отбираться из ^реформированного пула (Krug, 1972). Вследствие малых размеров нуклеокапсидов вируса гриппа они не могут быть точно идентифицированы в зараженных клетках с помощью электронной микроскопии. Скопления нитей или волокон диаметром около 5 нм, наблюдаемые в цитоплазме, возможно, представляют вирусные рибо-нуклеопротеины (Apostolov et al., 1970; Compans et al., 1970b).

Имеющиеся данные указывают на то, что РНК-геном вирионов вируса гриппа состоит из 5—7 фрагментов (см. гл. 6).

Следовательно, любая инфекционная частица нуждается хотя бы в одной копии каждого фрагмента. Hirst (1962) пред-

положил, что нуклеокапсиды из внутриклеточного пула могут включаться в (вирионы случайно. Доля 'инфекционных вирио-нов Е популяции может быть увеличена путем включения дополнительных фрагментов РНК в средний вирной (Compans et al., 1970). Например, если для инфекционное™ необходимы пять различных фрагментов РНК, во каждый вирной содержит в целом 7 фрагментов, включенных в вирной случай.ю, то приблизительно 22% вир-ионов должны быть инфекционными. Свидетельства в пользу случайного включения фрагментов РНК были подкреплены недавними наблюдениями Hirst (1973) о том, что в вирусной популяции осуществляется рекомбинация между частицами, не образующими бляшек. Способность таких частиц участвовать в рекомбинации можно объяснить отсутствием одного или более фрагментов в частицах при варьировании отсутствующих фрагментов от одной частицы к другой; таким образом, подходящие нары дефектного вируса могут образовывать рекомбинанты.

Б. ПРОЦЕСС ОТПОЧКОВЫВАНИЯ ВИРУСА

Как и большинство вирусов, имеющих оболочку, вирус гриппа собирается на преформированных мембранах клеток; сборка осуществляется путем отпочковывания от плазматической мембраны. Первая демонстрация освобождения вируса от «летки с помощью процесса, не включающего лизис, 'была представлена Murphy и Bang (1952) в ранних электронно-микроскопических исследованиях клеток, зар;аженных вирусом гриппа. Были видны выступающие от 'поверхности клетки во внеклеточное пространство нитевидные и ■ шарообразные структуры. Вирусных частиц внутри клеток во время образования 'инфекционного вируса не было видно и. из этого, следовательно, явствовало, что вирусные частицы формировались на поверхности клетки. Используя меченные ферритином антитела, Morgan и со авт. (1961) наблюдали, что поверхность (клетки содержит вирусный антиген в тех областях, где формируется вирус. Более поздние электронно-микроскопические исследов;ания показали, что поверхность отпочковывающегося вируса содержит такую же, как и клетка-хозяин, мембрану со слоем выступов, соответствующих вирусным «шипам» на внешней поверхности. На внутренней поверхности вирусной мембраны имеется отсутствующий на поверхности клетки дополнительный электронно-плотный слой, который, вероятно, состоит из М-иолипептидов (Bachi et al., 1969; Compans, Dimmock, 1969; Apostolov et al., 1970).

Исследования в электронном микроскопе дали основания ■предположить порядок, в котором вирусные компоненты ас-

социируют на мембране клетки (Bachi et al., 1961; Compans, Dimmock, 1969; Compans et al., 1970b).

Первыми появляются белки вирусной оболочки, включаясь в некоторые области мембраны, которые должны иметь нормальную морфологию; однако .наблюдаемая специфическая адсорбция эритроцитов на этих областях мембраны указывает на присутствие здесь .НА-белка. Затем, по-видимому, М-белок (ассоциирует с внутренней поверхностью таких областей мембран, формируя электронно-плотный слой. Далее с мембраной в этих областях специфически связывается рибо-нуклеопротеин и происходит процесс отпочкования путем изгибания и выпячивания сегмента мембраны и окружения ассоциированного рибонуклеопротеина. Данные электрофореза в полиакриламидном геле также поддерживают идею о том, что белки оболочки ассоциируют с плазматической мембраной быстрее, чем РНП (Lazarowitz et al., 1971). Полипептиды клетки-хозяина вытесняются из мембраны, которая является предшественником оболочки вируса, так как подобные полипептиды не обнаруживаются в очищенных вирионах. Как уже упоминалось, остатки нейраминовой кислоты отсутствуют в оболочке отпочковывающихся частиц вируса гриппа, но присутствуют в соседних участках мембраны клетки (Klenk et al., 1970).

Эти данные доказывают резкий переход в химическом составе между оболочкой отпочковывающейся вирусной частицы и соседствующей мембраной клетки.

Однако, с другой стороны, важной особенностью процесса отпочкования является то, что вирусная оболочка непрерывна с плазматической мембраной клетки-хозяина и морфологически подобна ей (Compans, Dimmock, 1969). Как было упомянуто, липиды в этих оболочках имеют очень близкое сходство с липидами мембраны клетки-хозяина. Эти наблюдения предполагают, что липиды в неизмененной плазматической 'Мембране легко обмениваются с липидами в отпочковывающихся вирусных частицах путем радиальной диффузии.

Следовательно, оболочка отпочковывающегося вириона образуется из небольшого участка мембраны клетки, модифицированного включением белков оболочки вириона. Эта концепция, конечно, не заключает в себе необходимость синтеза ' всех компонентов оболочки на плазматической мембране.

Действительно, в течение длительного времени было известно, что составные части оболочки должны мигрировать на значительные расстояния из одного участка клетки в другие, чтобы добраться от места своего биосинтеза :к месту сборки оболочки. Breitenield и Schafer (1957) показали, что в клетках, зараженных вирусом гриппа, НА* сначала можно уви-

деть во всех частях .клетки и что он ш повышенной -концентрации локализован в околоядерной зоне. Позднее НА* накапливается в 'периферической области «летки, а также может быть продемонстрирован в тонких нитях, которые выступают из мембраны клеши.

Представление о том, что компоненты оболочки мигрируют изнутри «летки ,к поверхности, недавно было подтверждено и расширено серией работ с использованием фракционирования клеток и анализа вирусных белков в различных фракциях клеток. Эти работы также дают основание предполагать, что гликопротеин НА, а возможно, и другие белки оболочки синтезируются на шероховатом эндоплазматиче-оком ретикулуме (Compans, 1973a; Klenk et al., 1974). Как выявляется в пульс-чейз-экспериментах, через несколько минут НА обнаруживается уже в мембранах гладкого эндо-плазматического ретикулума (Compans, 1973a; Stanley et al.,. 1973; Klenk et al., 1974) и в плазматической мембране (Stanley et al., 1973). Хотя опыты по чейзу из гладкого эндоплаз-матического ретикулума в плазматическую мембрану и не были проведены, кажется правдоподобным, что НА мигрирует из шероховатого эндаплазматического ретикулума ас плазматической мембране, минуя гладкий эндошгазматиче-ский ретикулум. Следует отметить, что в течение всего времени такой миграции НА и другие белки оболочки являются составными частями мембран, вдоль которых они движутся; ОБИ никогда не обнаруживаются в виде растворенных белков.

Во фракциях гладких мембран, которые, как полагают, происходят главным образом из эндоплазматнческого ретикулума, находят все основные белки оболочки (Compans 1973a; Klenk et al., 1974). Однако их относительные .количества здесь отличаются от таковых в плазматической мембране и вир ионе (Stanley et al., 1973; Klenk et al., 1974). Соотношения М-белка к лликопротещдам НА более высокое в оболочке зрелого вириона, чем в мембранах эндоллазматичеокого ретикулума. Эти данные позволяют предположить, что лишь небольшое количество мембран, несущих гликопротеин НА, превращается в вирусную оболочку, а именно фракции мембран, в состав которых входят л белки, свободные от углеводов. Как уже указывалось, синтез М-белка может быть той стадией, которая лимитирует процесс сборки .вируса.

Различие скорости синтеза разных белков оболочки поддерживает 'гипотезу о том, что сборка оболочки—процесс многостадийный. С этой концепцией согласуется вопрос о процессе образования НА*, включающем последовательное присоединение углеводной части и протеолитическое расщепление в ходе миграции первичного генного 'продукта.

VIII. ОСВОБОЖДЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА

Проблема освобождения вируса гриппа из клетки-хозяина,

по-видимому, тесно связана с проблемой функции вирусной

NA*, о которой уже детально говорилось ранее (см. раз

дел V и гл. 4). То, что этот фермент играет существенную

роль в освобождении вируса, вытекало из способности анти

тел, специфичных к NA*, подавлять такое освобождение (Se-

to, Rott, 1966; Webster et al., Г968). К тому же такие антитела

предотвращают элюцию вируса с эритроцитов (Brown, Laver,

1968). Бактериальная NA*, которая не ингибируется антите

лами к вирусной NA*, способна освобождать вирус от клеток,

обработанных такими антителами (Compans et al., 1969;

Webster, 1970). С другой стороны, двухвалентные антитела

к NA также вызывают агрегацию вируса (Seto, Chang, 1969;

Compans et al., 1969; Webster, 1970), а одновалентные анти

тела не препятствуют освобождению вируса, хотя ингибируют

более 90% активности нейраминидазы (Becht et al., 1971).

Все эти данные, вместе взятые, позволяют предположить, что

двухвалентные антитела препятствуют освобождению вируса

путем связывания его с антигенами, присутствующими на по

верхности клетки, и путем ингибирования активности фер

мента. Роль нейраминидазы в освобождении вируса показа

ли также Palese и еоавт. (Г974), установившие, что этот фер

мент необходим для удаления нейр амиловой кислоты с ви

русной поверхности во избежание агрегации вирионов-потом-

ков на поверхности клетки.