1. Исследования по генетике, проведенные Burnet и сотрудниками

В начале исследований по генетике в качестве донора генетических свойств применяли почти исключительно NWS — нейротропный вариант штамма WS в силу его уникального свойства: способности размножаться в мозге мышей, вызывая нарушение координации, паралич и смерть после интра-церебрального введения. В опытах Burnet и Lind (1951a) другим партнером служил WSM — ненейротропное производное штамма WS. Кроме нейровирулентности, NWS и WSM отличались по стабильности НА. Гемагглютинирующая активность NWS исчезала в результате нагревания при 54 °С в течение 30 мин, тогда как НА WSM выдерживал нагревание при 62 °С. После того как смесь этих двух вирусов в соответствующей -пропорции ввели <в .мозг мышам, были выделены штаммы вирусов, обозначенные WS-NM, которые оказались нейровнрулентиыми для мышей, хотя и в различной степени, но имели НА, столь же устойчивый к нагреванию, как и у штамма WSM. Эти свойства оставались стабильными в течение по .крайней мере двух пассажей в куриных эмбрионах при предельных разведениях.

В следующей серии экспериментов (Burnet, Lind, 1951b; Burnet, Edney, 1951) было использовано несколько генетических маркеров при рекомбинации штамма NWS со штаммом Mel — ненейротропным штаммом, принадлежащим к серологическому подтипу, отличному OTNWS. Из мозга мышей, подвергшихся смешанной инфекции, -были выделены иейротроп-ные реком'бинанты с серологическими свойствами штамма Mel (NM-штаммы). Вирусы NM обладали чертами исходного штамма Mel, такими, как термостабильность НА и агглютинация эритроцитов, обработанных ферментом, разрушающим рецепторы (RDE). С другой стороны, NM-рекомбинан-ты оказывали сниженное ферхмеятативное воздействие -на овомуциновый ингибитор и с трудом элюировали с эритроцитов. Этими свойствами они походили на родительский штамм NWS. Однако в отличие от этого исходного штамма они легко переходили в индикаторное состояние1. Эти свойства NM-pe-камбинантов могут быть объяснены относительно слабой и 1 термолабильной активностью NA, характерной для штамма NWS. Штамм Mel не может быть переведен в индикаторное состояние 'благодаря присутствию стабильной NA. Штамм NWS также не может быть переведен в это состояние, но из-за своего термолабильного НА. Только когда термостабильный НА штамма Mel и термолабильная NA штамма NWS объединялись в NM-рекомбинанте, тот становился способным переходить в индикаторное состояние путем дифференциальной инактивации. В рекомбинанте NM можно видеть такую ассоциацию генетических характеристик, которая 'впоследствии была развита в концепции «сцепленных групп». Mel [НА (серотип Mel, термостабильный), NA (активная, термостабильная) ненейровирулентные] -NWS [НА (серотип NWS, термолабильный), NA '(слабая, термолабильная) ней-ровирулентные]—>-NM [НА (серотип Mel, термостабильный), NA (слабая, термолабильная) нейровирулентные].

1 После прогрева некоторых штаммов вируса гриппа (обычно при 56 °С в течение 60 мин) темагглютииацию можно 'было подавить с помощью некоторых муиопротеинов, к которым иепрогретый вирус нечувствителен. Это состояние называют индикаторным. Переход в индикаторное .состояние, как предполагается, является результатам инактивации NA.

Начиная с 1952 г. в опытах по генетике чаще, чем NWS, начинают использовать в качестве одного из участников штамм WSE, так как он лучше растет в аллантоисной полости куриного эмбриона. Пара штаммов WSE и Mel была, вероятно, наиболее интенсивно изученной комбинацией в исследованиях генетики вируса гриппа. Наиболее важные данные, полученные в этой серии опытов, могут быть суммированы следующим образом.

а) Фенотипическое смешение.Потомственный вирус из смешанной инфекции, особенно когда в нем находили нейротропные рекомбинанты NM, нейтрализовался как анти-Mel так и aнти-NWS-сыворотками (Fraser, 1953). Этот аномальный НА, по определению Fraser, отличался от простой смеси штаммов Mel и NWS и указывал на то, что большинство вирусных частиц имеет на своей поверхности антигенную мозаику.

б) Способность инактивированного вируса участвовать в генетических взаимодействиях. Инактивация одного из компонентов нагреванием при 56 °С в течение 30 мин не предотвращает появление рекомбинантов того же серологического типа, что 'и у прогретого компонента (Burnet, Lind, 1954b). Соответствующим образом подобранная степень инактивации одного из компонентов путам умеренного прогревания при 37 °С в течение 7 дней даже способствует обнаружению рекомбинантов. Однако вирус, инактивираванный эфиром, был неспособен образовывать рекомбинанты (Fraser, 1959a).

в) Группы сцепления. Штаммы Mel, либо WSE, либо.Ы\отличались по ряду легковыявляемых признаков (табл. 18). Признаки штамма Mel были обозначены как ABCDEF, штамма WSE — abcdef, а штамма NWS — b(c)(d)efg.

В этом случае примененная процедура селекции не позволяет выделить обратную форму рекомбинанта. Признаки ABDF, abdf всегда были связаны (сцеплены) и, таким образом, составляли одну группу сцепления, а признаки СЕ, се или CEG, ceg — другую. С точки зрения общепринятой ныне теории генетики вируса гриппа, предполагающей, что каждый фрагмент РНК кодирует один гаолипептид, существование групп сцепления непонятно, если не- предполагать, что все сцепленные маркеры представляют собой различные феноти-пичешие проявления одного кодируемого вирусом белка. Приведенные данные можно интерпретировать следующим образом. ABD и abd являются, несомненно, фенотипами НА*, а 'С и с —• NA* штаммов Mel и NWS соответственно. Причина того, что НА* прогретого штамма Mel не ингибировался муцином слюны овец, могла состоять в отсутствие у НА* штамма Mel средства к этому ингибитору. С другой стороны, НА* штамма Mel мог иметь сродство к овомуцину или меконие-ву ингибитору, но поскольку его NA термостабильна и способна разрушать эти ингибиторы даже после прогревания, в примененной реакции торможения гем.агглютинации подавления гемагглютинирующей активности не происходило. Для штамма NWS ситуация была противоположной. Как уже обсуждалось, свойство С, с представляет термостабильяость NA*. Если эта интерпретация верна, то способность к росту в легких мышей определялась НА* NWS. Следует, однако, отметить, что специфическое сцепление маркеров имеет место только при специфической комбинации родительских штаммов вируса; при рекомбинации штаммов WSE и САМ свойства F и I наследовались независимо от свойств НА* (Burnet, Lind, 1955). Для нейровирулентности присутствие NA* NWS, по-видимому, было необходимо по крайней мере для комбинации NWS и других H0N1 или HswlNl штаммов. Все нейротропные рекомбинаяты, полученные Burnet и соавт. из штамма NWS как одного из компонентов и штаммов WSM, SW-15, Mel или Ocean Island в качестве других, несли фенотипы, соответствующие NA* NWS (Burnet, Lind, 1951a, b). Нейротропный вариант, полученный независимо Appleby (1952) путем скрещивания штаммов NWS и Kunz, также имел свойства, согласующиеся с этой моделью. Рекомбинант NK определенно обладал ееротипом Kunz в реакции торможения гемалглютинации, так же как и при нейтрализации in ovo, но слегка нейтрализовался и ■антисывороткой к NWS. В отношении тканевого тропизма он был так же нейровиру-лентен, как и штамм NWS. Этот рекомбинант напоминал штамм NWS и по. своей чувствительности к ингибитору слюны, и по низкой активности фермента (нейраминидаза). NK, вероятно, получил НА* от штамма Kunz, a NA* — от штамма NWS. Небольшая степень нейтрализации анти-NWS-cbiBOpOT-кой могла быть причиной подавления многоциклового роста вируса в условиях постоянного присутствия антител, направленных против NA (см. гл. 12).

Считалось, что патогенноеть для куриных эмбрионов при инокуляции в хорион-аллантоис (свойство е) была тесно связана с нейровирулеятностыо для мышей (g) и с термолабильностью NA* NWS (с). Однако эти два вида вирулентности служат, по-видимому, различными проявлениями одного и того же генотипа. Fraser (1959d) сравнил вирулентность для двух названных хозяев у различных штаммов рекомби-нантов NM, выделенных или из мозга мышей, или из мозга куриных эмбрионов. Все штаммы, слабопатогенные для куриных эмбрионов, оказались нелатогеяяыми при внутримозго-вом введении мышам. Автор заключил, что эти две патоген-ности являлись различными степенями одного и того же на-следуемого качества, и нейровирулентность для мышей может быть обнаружена только при условии достижения некоторого уровня патогенности и для куриных эмбрионов.

г) Высокая частота рекомбинации. При проведении этих исследований вирусные клоны выделяли исключительно из эмбрионов, зараженных в предельном разведении. Минорные типы в вирусном потомстве обычно не могли быть получены до тех пор,"пока не использовались очень большие количества эмбрионов. В болышинстве случаев ракомбинанты выделяли с помощью таких методов селекции, как использование антисыворотки пли применение ограничивающей системы клеток-хозяев, или часто обоих этих методов. Следовательно, частота рекомбинации или доля рекомбинантов в вирусном потомстве не могла быть определена. Только при скрещивании штаммов Mel и WSE, когда оба типа вирусов вырастали до примерно одинаковых уровней, рекомбинацию исследовали количественно (Burnet, Lind, 1952). После заражения яиц,

лишенных эмбрионов, 'большими концентрациями обоих вирусов, достаточными для 'инфицирования всех клеток одновременно, инокулирующий вирус удаляли с помощью рецептор-разрушающего фермента (RDE). Урожай после одного цикла, снятый через 6—б'/г ч, анализировали, выделяя вирусные клоны при предельных разведениях и определяя свойства отдельных клонов. Среди 41 исследованного клона 'было 22 Mel, 6 М+, 9 WS~ и 4 WSE. Таким образом, частота рекомбинации равнялась 15/41, или 37%.

д) Перераспределение вирулентности. Когда рекомбинация между NWS и Mel имела место в мозге мышей или в хор'ион-алланто'исе (Куриных эмбрионов — селективных хозяевах для нейротропных вирусных штаммов, легко обнаруживались свойства (ABDF-ceg) яейротропного штамма Mel. Когда же смешанная инфекция проводилась в аллантоисной полости и клоны потомственного вируса выделяли без селектирующего процесса, штаммы с комбинированными свойствами А-се проявляли весь спектр нейролатогенности —от фактического отсутствия вирулентности до полной вирулентности, сравнимой с вирулентностью родительского штахмма NWS, но преобладали рекомбинанты с низкой или сомнительной вирулентностью. Однако эти рекомбинаяты с низкой или промежуточной патогенностыо хотя и не приводили к гибели взрослых мышей после внутримоэгового введения, но до некоторой степени размножались в мозге и вызывали смертельные инфекции при инокуляции в мозг 2—4-дневным мышам (Lind, Burnet, 1957). Эти штаммы являлись, по крайней мере частично, нейротропными. Аналогичную вариабельность 'патогенности NM рекомбинантов наблюдал Fraser (1959) при введении в хорион-аллантоис. Она изменялась от полной вирулентности, т. е. инвазии эмбрионов с геморрагическими повреждениями и последующей смертью, до продукции хорошо выявляемых фокусов на хорион-аллантоисе, но без инвазии эмбриона. Как указывалось, патогенность для куриных эмбрионов и нейровирулентность для мышей коррелировали. При использовании вирулентности в качестве маркера почти неизбежно приходится сталкиваться с таким непостоянством ее проявления. Burnet и соавт. назвали этот феномен «перераспределением вирулентности», ,и это 'был, вероятно, феномен, наиболее трудный для объяснения в 'генетических терминах. Вводя слово «перераспределение», авторы полагали, что степень вирулентности определяется количеством содержащихся в индивидуальном вирусном геноме независимо реплицирующихся и перераспределяющихся в процессе генетического взаимодействия копий предполагаемого «вирулентного гена» (Burnet, Lind, 1954a) или количеством копий в равной мере предполагаемого «супрессорного гена» в случае авирулентных мутантов (Lind, Burnet, 1958). Позд-

нее другие исследователи были склонны рассматривать 'вирулентность скорее как мультитенность, не оговаривая, означает ли это существование множества копий с одного и того же гена или что вирулентность имеет сложный характер, определяемый более чем одним геном. При интерпретации генетических исследований, в которых вирулентность выступала как маркер, необходимо иметь <в виду два следующих обстоятельства. Во-первых, вариабельность проявления вирулентности никоим образом не характерна для рекомбинантов, происходящих от вирулентного родительского штамма. Даже NWS сам по себе более или менее подвержен изменениям, если только не размножается в мозге мышей (что обеспечивает постоянный отбор вирулентных форм на фоне форм, менее вирулентных) или не пассируется в аллантоисной полости при предельном разведении (что поддерживает изначальные свойства). При пассажах в последнем случае при меньших разведениях неизменно имеется постеленный сдвиг в сторону меньшей нейровирулентноети (Burnet, 1951), указывающий на то, что она не дает преимущества этому вирусу в данной системе и что мутации в сторону меньшей вирулентности относительно часты. Во-вторых, вирулентность в отличие от других маркеров in vitro (таких, как серотип «ли термостабильность НА*) является свойством, которое можно распознать только после интенсивного размножения вирусов, и, следовательно, может быть подвержена изменениям в какой-либо стадии :многоциклового роста вирусов. Чтобы вирулентность стала очевидной, каждая стадия должна протекать с максимальной эффективностью. Малейшая несовместимость между различными генами внутри генома или введение неподходящего гена, не имеющего отношения к предполагаемому гену вирулен'гтшгти могут пяггтпоить эффективность процесса, приводя к уменьшенной вирулентности. В качестве примера можно указать на мутацию рекомбинанта М+ (ABDF-ce) в сторону M+d (AbdF'-cE)1, прл которой изменение в первой группе сцепления от ABDF до AbdF' (потеря термостабильности НА*, приобретение сродства к мукоидно-му рецептору овец и дальнейшая аттенуация патогенности для легких мышей) сопровождалось утерей патогенности для куриных эмбрионов при инокуляции в хорион-аллантоис — изменениями, затрагивающими вторую группу сцепления (Burnet, Lind, 1957b).