3. Механизм рекомбинации

Известные в настоящий момент особенности рекомбинации вируса гриппа имеют разительное сходство с особенностями рекомбинации реовирусов. Статистический анализ частоты рекомбинации между ts-мутантами реовирусов свидетельствует в пользу случайного группирования элементов генома. В случае вируса гриппа убедительные данные для такого заключения пока отсутствуют.

Вопрос о том, как осуществляется рекомбинация, является существенным для выяснения лути, по 'которому происходит сборка фрагментов РНК, а также для выяснения вопроса о существовании или отсутствии какого-либо направленного процесса, обеспечивающего сборку всех фрагментов РНК-Согласно одной гипотезе, сборка является сугубо случайным процессом (Hirst, 1962, 1973). При этом наряду с частицами, содержащими полный набор фрагментов РНК, неизбежно должно продуцироваться большое число дефектных частиц. Такие дефектные частицы, попадая в одну и ту же клетку,

должны комплементировать друг с другом, продуцируя инфекционный потомственный вирус. Согласно данным Hirst (197ц), а также Hirst и Pons (1973), если смесь двух штаммов вируса три 'относительно высокой концентрации выдерживают в течение определенного времени, а затем разводят и наносят на клетки, доля клеток, подвергшихся двойной инфекции, оказывается гораздо выше, чем в том случае, если смесь разводят сразу же после слияния двух вирусов или оба вируса разбавляют перед смешением. После достаточно продолжительного периода инкубации при 4 °С доля клеток, подвергшихся двойной инфекции, среди общего числа зараженных клеток становится постоянной, несмотря на концентрацию вводимых вирусов, как будто дважды инфицированные клетки образуются в результате одноударного, а не двух-ударного процесса, чего можно было бы ожидать для клеток, получающих две независимо инфицирующие частицы. Hirst предположил, что двойная инфекция, характеризующаяся одяоударным процессом, 'инфицируется предобразованными смешанными агрегатами. Если агрегат, включающий вирусные частицы с разными недостающими фрагментами РНК, входит в клетку, то благодаря топографической близости таких частиц шансы на успешное начало инфекции должны существенно возрасти. Такой механизм должен повышать шансы на рекомбинацию 'как в опытах по смешанной инфекции, так и в природе. Если образование смешанных агрегатов является универсальным феноменом, частота рекомбинации не должна быть столь значительной, как первоначально предполагалось, поскольку трудно отличить смешанные агрегаты от истинных рекомбинантов. Более того, интенсивная реактивация случайно дефектных вирусных частиц в процессе образования смешанных агрегатов должна бы сделать роль инфекционных вирионов гриппа сомнительной.

Случайная сборка фрагментов РНК могла бы обеспечивать вирусу преимущество благодаря сильно увеличенным шансам на рекомбинацию, но, с другой стороны, это может оказаться невыгодным, так как слишком мала вероятность того, что сгруппируется полный набор фрагментов. Возможным объяснением наблюдаемой частоты рекомбинации является постулированное выше образование дефектными вирусными частицами смешанных агрегатов. Compans и соавт. (1970) предложили также модель, которая постулирует упаковку в 'виряон большего числа фрагментов РНК, чем в основном наборе. Включение избыточных двух или трех фрагментов РНК на частицу существенно увеличивает долю полных частиц.

С другой стороны, Pons (1970) .предположил, что (фрагменты РНК удерживаются друг с другом с помощью белкового тяжа, состоящего из субъединиц РНП, и что вновь синтезированная РНК включается в РНП путем смещения с этого тяжа матричной РНК- Биологическая активность РНП, но не РНК (Hirst, Pons, 1972), и тесная связь РНП с РНК-синтезирующей активностью (Compans, Caliguiri, 1973) указывают на то, что в репликации РНК важная роль принадлежит именно РНП, а не свободной РНК- Эта гипотеза,, однако, должна предусматривать линейное расположение фрагментов генома, для чего, если не считать работу Mackenzie (1970), генетические исследования пока не в состоянии предоставить соответствующих данных.

Б. МНОЖЕСТВЕННАЯ РЕАКТИВАЦИЯ И КРОСС-РЕАКТИВАЦИЯ

И множественная реактивация, и кросс-реактивация являются генетическими рекомбинациями, включающими вирус,, который потерял инфекционность в результате повреждения своей РНК- Множественная реактивация имеет место в случае инактивированного вируса одного и того же генотипа, когда в множественно инфицированной клетке присутствует по меньшей мере один полный набор интактных фрагментов генома. Barry (1961) в опытах по множественной реактивации вирусов гриппа, инактивированных ультрафиолетом, сравнивал экспериментально полученные кривые типа доза — ответ применительно к множественности заражения и выхода вируса с теоретическими кривыми, построенными, согласно-рекомбинационной модели Luria и Dulbecco (1949), «а основании предположения о различном числе радиационно-чув-ствительных единиц. Большее совпадение наблюдалось с кривой, жогда предполагали, что геном состоит из шести ра-диационно-чувствттельных единиц. Соблазнительно приравнять радиационно-чувствительные единицы к фрагментам РНК- Однако, поскольку на выход вируса может воздействовать феномен фон-Магнуса или интерференция, неизбежные-в таких экспериментах, он может неточно отражать число клеток, продуцирующих вирус. Желательно, чтобы множественная реактивация вновь была количественно рассмотрена с применением усовершенствованных методов, таких, как анализ инфекционных центров или иммунофлюоресцентный подсчет инфицированных клеток.

Отсутствие множественной реактивации между неполными вирусами (феномен фон-Магнуса) можно объяснить тем, что-

у них нет общей части генома (Rott, Scholtissek, 1963). Элек-трофоретический анализ РНК выявил отсутствие самого больцгого фрагмента РНК в .препаратах вируса фон-Магнуса (Pons, Hirst, 1969; Choppin, Pons, 1970). Однако, по-видимому, пока еще преждевременно делать вывод о том, что именно этот фрагмент РНК представляет собой утерянную часть1 генома в вирусе фон-Магнуса, поскольку количественная корреляция между исчезновением фрагмента РНК и степенью «неполноты» вируса отсутствует. Профиль РНК остается неизмененным до тех пор, пока отношение БОЕ к единицам тсмагглютинации не упадет до 1:/3о и менее.

Кросс-реактивация — это рекомбинация между инактиви-ро'ванным вирусом и живым вирусом другого генотипа. Это взаимодействие интенсивно используют для выделения реком-бннантов, поскольку оно предлагает удобный путь отбора нужных их типов за счет сильно подавленного выхода инак-тивлрованного родительского вируса (Kilbourne, Murphy, I960), особенно в соединении с 'использованием для подавления живого родительского штамма селектирующих клеток-хозяев. Нет данных о там, что инактивация сама по себе существенно изменяет механизм рекомбинации или увеличивает уровень рекомбинации. Полученные типы рекомбинан-тов являются одинаковыми независимо от того, был ли один из родительских штаммов инактивирован или нет (McCahon, Schild, 1971).

Кросс-реактивацию использовали для установления доли генома, вовлеченной в проявление определенной функции. Путем сравнения уровня инактивации инфекционности с уровнем бляшкообразующей способности Sugiura и Ueda (1971) предположили, что для образования бляшек на клетках FL штамму NWS требуется около 7з генома. Аналогичные опыты, проведенные McCahon и Schild (1971), привели к заключению, что 50% генома вовлечены в функцию бляш-кообразования у FPV на клетках куриного эмбриона. Эти величины, вероятно, завышены с точки зрения возможности того, что образование бляшек является строгим критерием способности IK росту в определенных клетках, как уже обсуждалось в разделе IVB, 1.

В. КОМПЛЕМЕНТАЦИЯ

В табл. 23 приведен типичный пример комплементации между ts-мутантами, тогда как в табл. 24 указывается на отсутствие комплементации в случае другой пары мутантов. Мутанты, относящиеся к различным группам, комплементи-руют друг с другом при смешанной инфекции с уровнем комплементации, изменяющимся от 21 до 17 900 (Sugiura et al., 1972). Выход вируса при неразрешающей температуре, появ-

ляющегося в результате комплементации, обычно превышает