Структура вируса гриппа

П. В. ШОППИН И Р. В. КОМПАНС (P. W. CHOPPIN, Я. W. COMPANS)

I. Введение

Изучение вируса гриппа в течение длительного времени находилось «а передовом рубеже структурных исследований в вирусологии. Вирус гриппа одним из первых был изучен: помощью электронной микроскопии (Taylor et al., 1943), и при использовании именно этого объекта в качестве модели было "оказано, что некоторые вирусы образуются путем отпочкования от клеточных мембран (Murphy, Bang, 1952). Введение в экспериментальную вирусологию метода негативного контрастирования в большей степени стимулировало структурные исследования вирусов вообще, а вирус гриппа явился объектом наиболее ранних и ярких работ (Home et al., 1960; Hoyle et al., 1961), в которых было показано наличие у вируса оболочки с включенными в нее поверхностными «шипами» и внутреннего спирализованного нуклеокапсида. В последние годы вирус гриппа изучали с помощью многих физических и химических (методов, в результате чего этот вирус является в настоящее время одним из наиболее изученных оболочечных вирусов с точки зрения их структурной организации.

Огромный интерес к структуре и сборке вирусов гриппа связан с биологическим значением заболевания, которое вирусы гриппа вызывают у человека и животных. Кроме того, вирусы гриппа, как и другие оболочечные вирусы, являются прекрасной моделью для изучения 'клеточных мембран. Возможность использования вирусов в качестве такой модели обусловлена тем, что вирусные частицы обладают внешней оболочкой, которая формируется из клеточной мембраны и морфологически ей идентична. Удобство же использования оболочечных вирусов для этой цели заключается в том, что они представляют собой простую модель, (которую можно получить в высокоочищенной и гомогенной форме для физических, химических и биологических исследований. Вирионы гриппа содержат в своем составе лишь небольшое число вирусспецифических белков, состав 'которых может изменяться при селекции различных штаммов и мутантов и которые во многих случаях могут быть выделены в биологически активном состоянии. Липидный и углеводный состав вирионов гриппа можно изменить, варьируя тип хозяйских клеток, поскольку эти компоненты вирусных мембран определяются в основном клеткой-хозяином. Удобство использования вирусов в качестве моделей мембран подчеркивали многие авторы (Choppin et al., 1971; Lenard, Compans, 1974; Choppin, Compans, 1975; Compans, Choppin, 1975).

Настоящая глава посвящена описанию общего состава и морфологии частиц вируса гриппа и взаимодействия различных его компонентов. В последующих главах (см. гл. 3, 6, 10 и 12) дано детальное описание биологических и иммунологических свойств различных компонентов вирусной частицы, а также структуры нуклеиновой кислоты и некоторых индивидуальных белков. В литературе уже имеется несколько обзоров с изложением работ по изучению структуры и сборки вирионов гриппа (Compans, Choppin, 1971, 1973, 1975; Choppin et al., 1972; Schulze, 1973; Laver, 1973; White, 1974; Choppin, 1975).

СОСТАВ ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ

А. ОБЩИЙ ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА

Химический состав вирионов гриппа не может быть приведен абсолютно точно потому, что вирусная популяция гетерогенна, а также потому, что состав вирусной частицы в некоторой степени (для липидов и углеводов) определяется клеткой-хозино1М (см. далее). Тем не менее, приблизительный химический состав был определен: 0,8—1,1% РНК, 70—75% белка, 20—24% липидов и 5—8% углеводов (Ada, Perry, 1954; Frommhagen et al., 1959; Blough et al., 1967). Вирусная популяция обычно содержит большое число неинфекционных «неполных» вирусных частиц и, таким образом, приведенное содержание РНК отражает нижний предел величины, характерной для инфекционных вирионов, которые содержат полный набор фрагментов вирусной РНК. Тщательный анализ вирусных частиц, культивированных на клетках почки быка линии MDBK, для которых характерен высокий выход инфекционных частиц с низким по сравнению с другими клетками выходам дефектных вирионов (Choppin, 1969), 'наряду с дополнительным отделением полных частиц в градиенте плотности, по-видимому, должен дать уточненную величину содержания РНК в вирусной частице.

Определение точного значения относительной молекулярной массы 'вирионов гриппа также осложняется гетерогенностью вирусной популяции, получаемые величины варьируют в широких пределах. С помощью икжтронно-микроекопического и седиментационного методов анализа получены значения относительной молекулярной массы от 270-106 до 290-106 (Lauffer, Stanley, 1944; Scharp et al., 1945; Schramm, 1954). Низкое значение (151 - К6) было получено для вируса FPV на основе определения коэффициентов диффузии и седиментации (Schafer et al., 1952; Schramm, 1954), а более высокое (360-106) —на основе измерения содержания белка в вирионе и подсчета числа частиц с помощью электронного микроскопа '(Reimer et al., 1966). В связи с тем что размеры вирусных частиц варьируют, невозможно получить величину относительной молекулярной (массы, одинаковую для всех вирионов вирусной популяции. Кроме того, в случае оболочечных вирусов, форма которых непостоянна, а сами вирионы легко разрушаются, трудно ожидать высокой точности при получении результатов с помощью таких методов, как подсчет частиц и определение коэффициентов седиментации. Хотя величина массы вирионов гриппа варьирует по объективным причинам и нельзя привести одного и того же значения для всех вирусных частиц, и настоящее время между различными лабораториями имеется согласованное мнение о пределах величин содержания РНК и белков в вирусной частице.

Б. РИБУНОКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА

Содержание РНК в вирионах гриппа равно 0,8—1,1% (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956; Frommhagen et al., 1959). Поскольку в этих исследованиях не была точно установлена степень чистоты использованных вирусных препаратов, приведенная выше величина оставляет почву для некоторых сО(Мнений. Так, по данным Frisch-Niggemeyer и Hoyle (1956), содержание РНК в изолированном нуклеопро-теиде вируса гриппа равно 5,3%, в то время как, согласно более поздним исследованиям, эта величина составляет 10— 12% (Pons et al., 1969; Krug, 1971). Это указывает на невысокую точность определения содержания РНК в вирионе в ранних работах. Данная в этих работах (на основе определения содержания РНК в вирионе) величина для размера вирусного генома — приблизительно 2-Ю6 (Frisch-Niggemeyer, 1956)—также значительно ниже величины 4-Ю6—5-Ю6, определенной с помощью электрофореза вирусной РНК в геле.

Известные в настоящее время биологические и биохимические данные указывают на то, что РНК вируса гриппа существует в вирионе в виде нескольких фрагментов. Полное доказательство этого положения мы здесь не приводим, поскольку этот вопрос будет подробно обсужден в гл. 6. При электрофорезе вирусной РНК в полиакриламидном геле наблюдается шесть или семь фрагментов с относительной молекулярной массой в пределах от 3,5-105 до 10-105дальтонов1 (Skehel, 1971; Lewandowski et al., 1971; Bischop et al, 1971). Установлено, что размер фрагментов дискретен, а изучение их концов указывает на то, что возникновение фрагментов не связано с фрагментацией одной молекулы РНК или с ее расщеплением нуклеазой (Young, Content, 1971; Lewandowski et al., 1971). Размеры индивидуальных фрагментов РНК хорошо коррелируют с относительной молекулярной массой вирускодируемых полипептидов, и в связи с этим можно высказать предположение, что каждый фрагмент генома кодирует один вирусный полипептид. Вирусная РНК входит в состав внутривирусного спирализованного рибонуклеопротеида и, как будет показано ниже, были обнаружены дискретные по размерам рибонуклеолротеиды, содержащие различные фрагменты вирусной РНК-До настоящего времени не было получено убедительных доказательств существования ковалентной связи или специфической агрегации фрагментов вирусной РНК в вирионе или в инфицированной клетке. Агрегаты с относительной молекулярной массой около 3-Ю6 были получены при экстракции РНК из вирионов в присутствии двухвалентных .катионов. При тепловой обработке эти агрегаты переходили в медленно седиментирующие структуры (Agrawal, Bruening, 1966; Pons, 1967). В одном из электронно-микроскопических исследований сообщалось об обнаружении молекул РНК с относительной молекулярной массой 3-Ю6, диссоциирующих на меньшие по размерам молекулы при рН 3,0 (Li, Seto, 1971). Однако наблюдаемая гетерогенность не является доказательством того, что имеется специфическая агрегация всех фрагментов вирусного генома.

Содержание в вирионе различных фрагментов РНК варьирует. Несколько пассажей вируса гриппа с высокой множественностью заражения приводят к репродукции неинфекционных частиц, что отражается в низком отношении инфекционности препаратов к их гемагглютинирующей активности (von Magnus, 1964). Такой вирус называют неполным. Он характеризуется отсутствием самого большого по размерам фрагмента РНК и увеличенным содержанием низкомолекулярных гетерогенных фрагментов (Pons, Hirst, 1968; Dues-berg, 1968; Choppin, Pons, 1970). Некоторые различия наблюдаются в седиментационных профилях РНК, выделенных из различных штаммов, а также из вирусов одного штамма при разном времени культивирования и различной множественности заражения (Barry et al., 1970). Такого рода различия могут отражать неодинаковую скорость синтеза разных фрагментов вирионной РНК; при этом низкомолекулярные фрагменты, вероятно, синтезируются с большей скоростью, чем большие по размерам.

В. БЕЛКИ