14.2. Современные методы контроля

В последние годы увеличилась база новых автоматизированных и ускоренных методов микробиологического контроля (экспресс-методов). Основная цель разработки этих методов – сократить продолжительность проведения анализа и снизить трудоемкость.

Известны такие инструментальные способы определения количества микроорганизмов, как кондуктометрический, биолюминесцентный, метод микроскопии.

Кондуктометрический метод качественного и количественного определения микроорганизмов – автоматизированный метод, основанный на импедансных технологиях (динамической регистрации импеданса культуральной среды). Суть метода – измерение электрической проводимости питательной среды, которая изменяется в процессе роста и метаболизма микроорганизмов. Измерение проводится электродом, находящимся в питательной среде. Разработано несколько приборов, работающих по этому принципу: Malthus System, Rabit System, Bactometer, Bactrac.

Все эти приборы имеют следующие общие составляющие:

– инкубаторная система (для поддержания постоянной температуры проб в ходе проведения анализа);

– контрольный блок для измерения активной проводимости или емкостного сопротивления;

– компьютерная система для обработки результатов.

Биолюминесцентный метод основан на способности многих веществ биологического происхождения и красителей к свечению под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего света и переходят в возбужденное состояние, которое характеризуется более высоким энергетическим уровнем. В таком состоянии они находятся непродолжительное время и вновь возвращаются в обычное состояние. Этот переход сопровождается отдачей избытка энергии в виде света – люминесценцией.

В связи с тем, что высокоэнергетическим соединением любой живой клетки – растительной, животной, микробной – является АТФ, ясно, что чем грязнее поверхность, тем большее количество АТФ на ней присутствует, то есть в данном случае АТФ является показателем чистоты.

Количество АТФ измеряют при помощи люминометров, которые выпускают известные фирмы: Merck, Lumak, Foss Electric и др. Измерительный комплекс прибора состоит из люминометра и специальных реактивов. Люминометр считает фотоны света, образующиеся в ходе реакции биолюминесценции, которые прямо пропорциональны количеству АТФ. Смыв с поверхности аппарата помещают в люминометр. При этом АТФ образца вступает в реакцию с ферментом люциферазой, который входит в состав тест-системы. В процессе взаимодействия фермента с АТФ происходит эмиссия света, который регистрируется прибором. Результаты получают практически сразу же, так как по интенсивности свечения можно судить о степени загрязнения оборудования.

Однако с помощью биолюминесцентного метода нельзя определить количество микроорганизмов на поверхности, а только ответить на вопрос, достаточно ли тщательно была произведена мойка оборудования. Отсюда следует, что смывы должны браться после того, как поверхность была вымыта и ополоснута, то есть перед дезинфекцией.

Программа РЗ-Klean Check (Henkel Ecolab) для моментальной проверки чистоты по АТФ. Программа позволяет определить критические контрольные точки на предприятии и постоянно проверять эти точки в целях обеспечения соответствия предприятия гигиеническим стандартам. В программе используется методика стерильных снаб-тестов для взятия мазка – система Uni-Lite Xcel, предлагаемая компанией «Биотрейс».

Преимущества системы:

– результаты готовы в течение нескольких минут;

– результаты проверок указывают на три состояния: хорошо, удовлетворительно, плохо;

– контроль и анализ данных;

– возможность анализа тенденций.

Система представляет собой портативный прибор, предназначенный для применения непосредственно на производстве или в лаборатории. Портативность прибора усилена тем, что он оснащен встроенным принтером, который дает распечатку результатов каждой пробы непосредственно на месте проверки. Результаты выводятся на дисплей в четком формате таблицы, в которой показаны фактические результаты измерений, для большей ясности окрашенные в кодовые цвета – зеленый, янтарный или красный. Накопленные результаты можно выразить графически, выстраивая графики на основании различных критериев.

Для небольших предприятий разработан менее дорогостоящий метод, основанный на определении белка. В продаже имеются тест-наборы, которые оценивают количество белка, оставшееся на поверхности после мойки. В основе теста лежит традиционная биуретовая реакция, что позволяет обнаружить пептидные связи. В этом тесте обработка сульфатом меди в щелочных условиях и добавление индикатора (бицинхониновая кислота) приводят к образованию пурпурной окраски в присутствии белка. Интенсивность окраски зависит от количества белка.

К методам микроскопии можно отнести метод флюоресцентной микроскопии и экспресс-метод проточной цитометрии.

Для оперативного получения результатов по санитарно-гигиеническому контролю производства широко применяют пластины «ЗМ Петрифильм» (компании «ЗМ») – тест-системы, которые полностью готовы к применению. В состав среды пластин входят: стандартный набор питательных веществ, растворимый в холодной воде гелеобразный агент и индикатор, облегчающий подсчет колоний. Находящаяся на пластинах специфическая среда предназначена для идентификации и количественного учета различных групп микроорганизмов путем подсчета выросших колоний.

С помощью пластин «Петрифильм» можно оценить как качество чистоты поверхностей оборудования так и уровень микробиологической чистоты воздуха (методом седиментации), качество сырья и готовой продукции.

Перед анализом поверхность пластин увлажняют для формирования устойчивого гелевого слоя – наносят 1 см³ стерильной воды или физиологического раствора. Далее оставляют ее на один час для затвердевания геля. После чего пластину прикладывают к анализируемой поверхности, либо оставляют открытой на воздухе в течение 15 мин, затем инкубируют.

При исследовании больших производственных площадей или оборудования на микробиологическую чистоту обычно берут смыв. Для этого используют смоченный в стерильной воде тампон, с помощью которого делают смыв с тестируемой поверхности. Затем его помещают во флакон, энергично встряхивают микроорганизмы в воду, после чего высевают 1 см³ полученной пробы на сухую исходную пластину, которую затем инкубируют и подсчитывают выросшие колонии микроорганизмов.

Фирма Миллипор предложила метод микробиологического анализа, основанный на мембранной фильтрации. Метод очень прост и удобен, он заключается в отборе проб, инкубации и подсчете результатов анализа. Метод может быть использован для анализа воды, пищевых продуктов, а также производственных поверхностей. Наборы для анализа состоят из сэмплеров и «сваб тестов». Сэмплер представляет собой пластмассовый держатель, в котором закреплен мембранный фильтр с сеткой. Под фильтром находится адсорбирующая подложка с высушенной питательной средой. Самплеры стерильно упакованы и, в зависимости от цвета, служат для определения общего микробного числа, коли-индекса, дрожжей или плесневых грибов.

Для контроля жидкости в нее погружают самплер, при этом подложка впитывает в себя ровно 1 см³ жидкости, которая смачивает питательную среду. Микроорганизмы большего размера, чем поры фильтра, задерживаются на его поверхности и во время инкубации образуют колонии.

В том случае, когда необходимо оценить уровень микробной загрязненности производственных поверхностей, используют наборы, состоящие из самплера и тампона во флаконе со стерильным буфером (сваб тестов). Дизайн тампона позволяет достичь любого места, где могут расти бактерии. Для тестирования нужно провести по поверхности сваб тестов, затем возвратить его обратно во флакон, встряхнуть для переноса микрофлоры с тампона в буфер. После этого в буфер помещают самплер на 30 с. За это время подложка впитывает в себя 1 см³ буфера, после чего остаток буфера выливают, а самплер во флаконе помещают в инкубатор. Выросшие колонии подсчитывают или делают быструю оценку, пользуясь прилагаемой сравнительной таблицей.

Разновидностью предыдущего метода являются контактные слайды Envirocheck, которые широко применяют для анализа критических контрольных точек в рамках микробиологического контроля поверхностей заводских линий и оборудования. Контактные слайды покрыты питательными средами, готовыми к использованию.

Для проведения анализа необходимо отвинтить крышку и вынуть слайд из пробирки, не прикасаясь к поверхности агара. Затем положить слайд на поверхность и сделать отпечаток или погрузить слайд в исследуемую жидкость, затем поместить его в контейнер, плотно закрыть крышку и термостатировать.

Контактные чашки Родека являются основой международных стандартов при обследовании уровня контаминации поверхностей в пищевой и фармацевтической промышленности. Чашки имеют выпуклое дно, и оценка контаминации происходит путем прикладывания чашки с плотной средой к исследуемой поверхности, после чего чашку с осевшими на агар микроорганизмами культивируют и оценивают контаминацию на 1 см² путем подсчета колоний. Для облегчения этой задачи дно имеет сетку с ячейкой 1 см².

Чашки Родека вентилируемые. Крышка чашки имеет резьбу и надежно соединяется с чашкой во время транспортировки и инкубации, что предотвращает повреждение поверхности среды до взятия пробы и постороннюю контаминацию – после взятия пробы.