7.1. Выявление посторонних микроорганизмов в дрожжах

С целью выявления микроорганизмов различных физиологических групп (молочнокислых и гнилостных бактерий, лейконостока, бактерий группы кишечной палочки, диких дрожжей) используют питательные среды определенного состава, на которых данный вид имеет преимущественное развитие и легко может быть идентифицирован.

Для выявления бактерий в объектах с численным преобладанием дрожжей используется метод высева проб на плотные питательные среды с нистатином, который представляет собой антибиотик, обладающий сильным фунгицидным действием. Он задерживает рост дрожжей и плесневых грибов, но не влияет на бактерии. Нистатин разводят в стерильной воде и вносят в чашки Петри при высеве исследуемых проб на твердые среды, при этом колонии дрожжей не образуются, и поэтому колонии бактерий легко могут быть выявлены и учтены. Концентрация антибиотика, полностью задерживающая рост дрожжей, равна 20 единиц на 1 мл среды. Нистатин нестоек при повышенной температуре и на свету, поэтому хранить его необходимо в темном холодном месте. Растворы его могут храниться в этих условиях в течение 2–3 суток. Метод посевов с нистатином прост, удобен в работе и позволяет выявить инстинную картину бактериальной обсемененности дрожжевого производства, начиная с чистой культуры и заканчивая готовой продукцией.

Для выявления основных групп микроорганизмов используют среды пяти составов:

1. На сусло-агаре с мелом и нистатином выявляют и учитывают все молочнокислые бактерии по колониям, образующим зону просветления мела. На этой среде колонии лейконостока и лактобацилл различить сложно (рис. 7.1).

Рис. 7.1. Колонии молочнокислых бактерий на сусло-агаре с мелом

2. На плотной дрожжевой питательной среде с сахарозой и нистатином, учитывают лейконосток по характерным колониям в виде прозрачных капель.

3. Гнилостные бактерии выявляют посевом проб дрожжей на молочный агар с нистатином. На этой среде вокруг колоний гнилостных бактерий появляются видимые прозрачные зоны вследствие протеолиза (расщепления) казеина молока, окрашенного в белый цвет, на более простые бесцветные компоненты. По величине этой зоны возможно опосредованно оценить протеолитическую активность бактерий (рис. 7.2).

Рис. 7.2. Колонии гнилостных бактерий

на молочном агаре

4. Количество нитритообразующих бактерий можно определить высевом на среду с нитратом, при этом для создания анаэробных условий культивирования застывшую среду с посевом проб следует залить еще одним слоем питательной среды. Денитрификаторы учитывают по пузырькам газа между слоями среды. Количество нитритообразующих бактерий можно примерно учесть и на молочном агаре, в связи с тем, что подавляющее большинство гнилостных бактерий обладают способностью восстанавливать нитраты среды в нитриты.

5. Для выявления и учета посторонних дрожжей используют синтетическую среду с лизином, являющимся единственным источником азота. Дрожжи-сахаромицеты, не усваивающие лизин, не растут на этой среде либо образуют точечные, едва заметные колонии за счет усвоения небольшого количества азота, содержащегося в агаре, в то же время аспорогенные дрожжи, ассимилирующие лизин, развиваются в виде крупных колоний.

Перед посевом пробы дрожжей (1 г) или культуральной жидкости (1 см³) разводят количественно стерильной водой, для чего используют метод последовательных разведений – от 10^–1 до 10^–8. Для приготовления 1-го разведения (10^–1) 1 см³ анализируемой пробы стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 см³ воды для разведения. Пипетку нельзя погружать в воду более чем на 3мм во избежание смывания микроорганизмов с ее наружной поверхности. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки путем многократного заполнения и опорожнения пипетки, набирают 1 см³ из первого разведения и переносят в следующую пробирку с 9 см³ жидкости, получая разведение 10^–2. Эти операции повторяют до получения необходимого ряда разведений.

Общее количество дрожжей в образце определяют посевом на сусло-агар из самых больших разведений. Ввиду того, что степень обсемененности дрожжей микроорганизмами разных групп не одинакова, для каждой группы следует подбирать определенное разведение. Для того чтобы получить нужную густоту посева (20–100 колоний на чашку Петри), посев делают из трех разведений не менее, чем на две чашки каждый. Примерная схема посева прессованных дрожжей, содержащих значительное количество посторонних микроорганизмов, приведена в табл. 7.1.

Таблица 7.1

Схема посева товарных дрожжей

Группы микро-организмов	Питательные среды	Разведение 1 г дрожжей
		10–2	10–3	10–4	10–5	10–6	10–7	10–8
Общее количество дрожжей	Сусло -агар	–	–	–	–	–	2	2
Посторон-ние дрожжи	Синтетическая среда с лизином	–	–	–	–	2	2	2
Молочно-кислые бактерии (лактобациллы и лейко-носток)	Сусло-агар с мелом и нистатином	–	–	–	2	2	2	–
Лейконосток	Дрожжевой агар с сахарозой и нистатином	–	–	–	2	2	2	–
Гнилостные бактерии	Молочный агар с нистатином	–	2	2	2	–	–	–

Примечание: 2 – количество чашек Петри.

При микробиологическом анализе дрожжей с незначительным количеством посторонних микроорганизмов (чистой культуры или естественно чистой культуры) посев проводят из меньших разведений исходной пробы (табл. 7.2).

Таблица 7.2

Схема посева дрожжей чистой и естественно-чистой культуры

Группы микроорганизмов	Питательные среды	Разведение 1г дрожжей
		10–2	10–3	10–4	10–5	10–6
Посторонние дрожжи	Синтетическая среда с лизином	2	2	2	–	–
Молочнокислые бактерии (лактобациллы и лейконосток)	Сусло-агар с мелом и нистатином	–	–	2	2	2
Лейконосток	Дрожжевой агар с сахарозой и нистатином	2	2	2	–	–
Гнилостные бактерии	Молочный агар с нистатином	2	2	2	–	–

Примечание: 2 – количество чашек Петри.

После разведения проб дрожжей проводят посев в чашки Петри. Для этого в стерильные чашки с соблюдением правил асептики стерильной пипеткой после перемешивания вносят по 1 см³ суспензии дрожжей из соответствующего разведения и водную суспензию нистатина. Чашки предварительно маркируют со стороны донышка, а не крышки, чтобы исключить случайную замену их при падении, сдвиге и т. д. Затем в чашки, предназначенные для выявления молочнокислых бактерий, вносят стерильный порошок мела и равномерно распределяют его в находящейся в чашке жидкости. Заключительным этапом посева является внесение расплавленных и охлажденных до 40–50 С сред в количестве 10–12 см³ в чашки Петри. Толщина слоя питательного агара должна быть 4–5 мм. Незамедлительно расплавленную среду и посевной материал тщательно перемешивают круговыми движениями, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Для охлаждения и застывания среды чашки оставляют на холодной горизонтальной поверхности на 10–15 мин. После застывания питательной среды посевы помещают в термостат, инкубируют при 30 С. Результаты выражают как количество бактерий в 1 см³ (или в 1 г) исходного материала. Для этого количество выросших колоний умножают на засеянный с учетом разведений объем пробы. За окончательный результат принимают среднее арифметическое по двум параллельным чашкам или двум соседним разведениям.

Подсчет выросших колоний лейконостока проводят через 24 ч, колонии гнилостных бактерий в зависимости от их протеолитической активности могут появиться в разный срок – от 24 до 72 ч инкубации. При этом следует иметь в виду, что некоторые виды гнилостных бактерий настолько интенсивно разлагают белок молочной среды, что ее просветление может происходить очень быстро по всей поверхности чашки. Совместно с хлебопекарными дрожжами могут развиваться и гнилостные бактерии, обладающие невысокой протеолитической активностью и образующие зоны просветления казеина лишь через 72 ч. Несмотря на это массовое развитие таких бактерий может снизить стойкость прессованных дрожжей.

Нитритообразующие бактерии учитывают по наличию пузырьков газа через 5–7 сут.

Учет количества молочнокислых бактерий проводят через 3–5 сут роста, когда вокруг колоний образуются четкие зоны просветления мела.

Посторонние дрожжи формируют колонии через 48–72 ч. При необходимости оперативного выявления источника контаминации производства посторонними дрожжами можно применить качественный анализ, который заключается в посеве исследуемого объекта в жидкую ацетатную среду. На поверхности этой среды дикие дрожжи уже через сутки образуют пленку.

Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в дрожжах

Для выявления количества дрожжей, в котором содержатся БГКП, разводят 5 г дрожжей в 45 мл пептонно-солевого раствора (1 % пептона и 0,5 % хлорида натрия, рН 7,2–7,4). Затем переносят 10 см³ суспензии (или 1 г дрожжей) в 90 см³ среды Кесслера и по 1 мл (или 0,1 г дрожжей) – в 9 см³ среды Кесслера и в 9 см³ пептонно-солевого раствора. Далее 1 см³ дрожжевой суспензии из пробирки с пептонно-солевым раствором (или 0,01 г дрожжей) переносят в 9 см³ среды Кесслера и 0,1 см³ (0,001 г дрожжей) – в 9,9 см³ среды Кесслера. Во все образцы со средой Кесслера помещены поплавки для скопления выделяющегося газа. Исследуемые образцы инкубируют при 36–37 С в течение 24–48 ч (рис. 7.3, 7.4).

Рис. 7.3. Схема определения БГКП в дрожжах

Рис. 7.4. Схема определения БГКП в культуральной среде

Если по истечении времени инкубации в среде Кесслера наблюдается изменение цвета и появление газа в поплавке, либо только изменение цвета, необходимо из этого образца произвести посев истощающим мазком на поверхность среды Эндо для получения изолированных колоний.

Если на среде Эндо выросли типичные колонии (темно-красные, красные с металлическим блеском, выпуклые с красным центром), образованными грамотрицательными палочками, это значит, что в анализируемой навеске дрожжей присутствуют БГКП. В соответствии с СанПиН 2.3.2. 1078-01 содержание микроорганизмов в хлебопекарных дрожжах должно быть ограничено следующими микробиологическими показателями (табл. 7.3).

Таблица 7.3