8.2. Асептические условия выращивания дрожжей на лабораторных стадиях

Цель лабораторных стадий разведения дрожжей состоит в том, чтобы получить достаточное количество биомассы, позволяющее перейти к выращиванию дрожжей на производстве. Разведение дрожжей состоит из последовательности циклов с постепенным увеличением биомассы вплоть до внесения дрожжей в промышленный ферментер. Основными показателями эффективности этого процесса являются чистота штамма, жизнеспособность и микробиологическая чистота дрожжей. Поэтому мероприятия, направленные на создание асептических условий при выращивании дрожжей лабораторных стадий, должны проводиться с особой тщательностью, с соблюдением правил, обеспечивающих полное отсутствие посторонних микроорганизмов.

Требования к лаборатории

Лабораторные стадии выращивания чистой культуры дрожжей проводятся в заводской микробиологической лаборатории, для которой выделяется светлое, достаточно просторное помещение. Общее размещение лаборатории и ее инфраструктура должны соответствовать требованиям ГОСТ Р51446-99. В соответствии с требованиями ГОСТ лаборатория должна иметь следующие комнаты: для проведения микробиологических работ с изолированным помещением (боксом), в котором в условиях строгой стерильности проводят пересевы лабораторных стадий чистой культуры дрожжей; для подготовительных работ (препараторская, моечная, приготовление и розлив питательных сред), стерилизационную, термостатную, для отдыха и приема пищи; для работы с документацией и литературой; подсобное помещение.

Помещения необходимо располагать так, чтобы обеспечить защиту их от влияния внешних факторов (повышенная температура, влажность, запыленность, шум, вибрация), организовать прохождения чистых и зараженных материалов без пересечения путей. В каждом помещении должно быть холодное и горячее водоснабжение, а также емкость с раствором для дезинфекции рук.

Аппаратура и оборудование

Микробиологическая лаборатория должна быть оборудована

– автоклавами (не менее 2 шт.);

– электрическими суховоздушными или водяными термостатами, отрегулированными на разные температурные режимы;

– холодильниками (несколько штук);

– дистилляторами;

– центрифугами;

– рН-метром;

– весами лабораторными, техническими, аналитическими разных классов точности;

– водяной баней с автоматическим терморегулятором для сохранения расплавленных агаровых сред до употребления или культивирования посевов при постоянной температуре;

– стерилизационным сушильным шкафом с автоматическим терморегулятором для стерилизации стеклянной посуды;

– электроплитками, спиртовыми горелками;

– рефрактометром;

– микроскопами различных систем.

Для исследований и облегчения трудоемких операций используют различные приборы и оборудование, такие как дозатор питательных сред и реактивов, механический смеситель, устройства для фильтрования, прибор для подсчета колоний, аппарат для культивирования в модифицированной среде (анаэростат).

Из лабораторной посуды необходимо иметь: стеклянные или пластиковые емкости (пробирки, колбы, флаконы, бутыли); стек-лянные или пластиковые чашки Петри (как правило, диаметром 90–100 мм); пипетки пастеровские и градуированные вместимостью 10, 2, 1 см³; воронки, цилиндры, мензурки, капельницы и другую мерную посуду. В лаборатории должно быть достаточное количество предметных и покровных стекол, лабораторных инструментов: ножниц, пинцетов, скальпелей, кювет, игл и петель для посевов и пересевов культур.

Бокс представляет собой небольшую комнату, разделенную на две части. Основное помещение предназначено для проведения микробиологических работ, вторая часть бокса (предбоксник) предназначена для того, чтобы не допустить прямого контакта помещения для пересевов с наружным помещением. Такое устройство исключает резкое перемещение воздуха и, следовательно, занесение извне посторонней микрофлоры. В предбокснике должен находиться комплект чистой рабочей одежды: халат, колпачок или косынка и тапочки, в которых можно находиться только в помещении бокса.

Устройство бокса должно соответствовать определенным санитарным правилам. Обязательным требованием является высота потолка, которая должна быть не ниже 3 м – этого требуют правила безопасности работы с ультрафиолетовым излучением, которое используется в бактерицидных лампах для стерилизации бокса. Места примыкания стен к потолку и полу должны быть округленными. Стыки элементов и конструкций перегородок, потолка и пола должны быть герметичными. Все поверхности в боксе должны иметь покрытия, допускающие обработку дезинфицирующими составами, стойкие к ультрафиолетовому излучению, применяемому для стерилизации. Полы в боксе рекомендуется выполнять без швов из износостойких антистатических материалов.

В боксе должен находиться стол для посевов и стул. Желательно, чтобы там же были размещены холодильник с хранящимися в нем музейными культурами, термостат на 26 С, шкаф для питательных сред и стерильной посуды. Такое устройство исключает вынос емкостей с промежуточными лабораторными стадиями из бокса и значительно снижает риск инфицирования чистой культуры.

На рабочем столе в боксе необходимо иметь спиртовку, спички, штатив для пробирок, биологическую петлю и иглу, восковой карандаш по стеклу или маркер, спирт, вату, стакан для использованных в работе пипеток и шпателей. Перед началом работы руки и поверхность стола обязательно протирают 70 %-м раствором этилового спирта.

Помещение бокса стерилизуют с помощью бактерицидных ламп, прикрепленных к стенкам бокса на уровне 1,5–2 м от пола, одну лампу устанавливают на расстоянии 60–70 см над поверхностью стола. Бактерицидная лампа представляет собой источник излучения, в спектре которого имеется преимущественно ультрафиолетовое (УФ) бактерицидное излучение со спектральным диапазоном 205–315 нм. Наиболее чувствительны к воздействию ультрафиолета вирусы и бактерии в вегетативной форме, в меньшей степени – грибы и наименьшей степенью чувствительности обладают споровые формы бактерий.

При стерилизации бокса следует учитывать, что УФ излучение действует поверхностно – оно проникает на глубину нескольких микрон (обычное оконное стекло толщиной около 3 мм уже ослабляет поток ультрафиолета на 90 %), поэтому необходима предварительная влажная уборка бокса, в том числе и бактерицидных ламп, при этом нельзя касаться лампы руками.

Бактерицидные лампы разделяются на озонные и безозоновые. У озонных ламп в спектре излучения присутствуют спектральные линии с длиной волны короче 200 нм, вызывающие образование озона в воздушной среде. Озон обладает сильным бактерицидным действием, но для человека он ядовит, и поэтому находиться в помещении, где включены озонные лампы, опасно. После применения таких ламп можно приступать к работе только спустя 20 мин.

Для того, чтобы качество стерилизации в боксе соответствовало требованиям асептики, необходимо произвести расчет времени стерилизации. Эффективность работы лампы характеризуется ее производительностью, которая определяется объемом (в м³) обеззараживаемой воздушной среды, в котором за 1 ч дожжен быть достигнут заданный уровень бактерицидной эффективности для золотистого стафилококка.

Высокая биологическая активность УФ лучей требует соблюдения мер безопасности. Подача питания к бактерицидной установке от электрической сети должна производиться с помощью отдельных выключателей, расположенных вне бокса. Над каждым выключателем должна быть надпись «Бактерицидные облучатели». Необходимо вести учет времени каждой лампы с отметкой в «Журнале регистрации и контроля бактерицидной установки», который является официальным документом, подтверждающим работоспособность и безопасность эксплуатации бактерицидной установки. Контрольные проверки состояния бактерицидной установки осуществляются один раз в год представителями Госсанэпиднадзора. Результаты проверки оформляются в виде протокола и заносятся в журнал с заключением, разрешающим дальнейшую эксплуатацию.

Ежедневно после окончания рабочего дня в лаборатории следует проводить уборку с применением моющих средств. Уборочный инвентарь для бокса должен храниться отдельно. Еженедельно проводят генеральную уборку с применением дезинфицирующих средств. Стеклянные поверхности бактерицидных ламп следует не реже одного раза в неделю протирать ветошью, смоченной спиртом. Это необходимо в связи с тем, что любое загрязнение на поверхности колбы бактерицидной лампы, особенно жировые следы рук, способно сильно ослабить поток ультрафиолетовых лучей, к тому же не нашедшая выхода энергия излучения перегревает лампу, что ведет к сокращению срока ее работы.

В лаборатории кроме бокса-комнаты можно использовать ламинарный бокс. Он представляет собой устройство, имеющее вид вытяжного шкафа, внутри которого в рабочей зоне в режиме рециркуляции проходят однонаправленные (ламинарные) потоки воздуха, горизонтальные или вертикальные. Для создания воздушного потока применяется центробежный вентилятор, часть мощности которого отводится на образование защитного воздушного занавеса на входе системы. Циркулирующий и отводимый воздух обеззараживается фильтрованием. Эффективность фильтрации составляет 99,999 % частиц размером более 0,3 мкм.