1. Характеристика хлебопекарных дрожжей
Х
а
б
Рис. 1.1. Хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae на сусло-агаре: а – колонии (х3), б – клетки (х1000).
Дрожжи издавна применялись в практике бродильных производств и в хлебопечении, даже тогда, когда природа их была неизвестна. В настоящее время в хлебопекарном производстве нашли широкое применение дрожжи различных штаммов, относящиеся к виду S. сerevisiae. Дрожжи этого вида обладают способностью использовать простые сахара среды двумя путями: ферментировать их в условиях дефицита кислорода с образованием этанола и диоксида углерода или окислять до диоксида углерода и воды при достаточном количестве кислорода в среде. Благодаря этим свойствам хлебопекарные дрожжи быстро размножаются и накапливают биомассу в условиях интенсивной аэрации, создаваемой в ферментерах, а затем при внесении в тесто ферментируют углеводы муки и теста, оказывая существенное влияние на объем готового хлеба и пористость мякиша. Выделяя при этом углекислый газ и спирт, а также ряд побочных продуктов брожения (уксусный альдегид, бутиловый, изобутиловый, изоамиловый спирты, органические кислоты) дрожжи придают специфический вкус и аромат хлебобулочным изделиям.
Кроме того, дрожжи являются источником микробной биомассы в пище человека, с которой организм получает дополнительное количество таких важных питательных веществ, как белок, аминокислоты, витамины и минералы.
Ферменты дрожжей (-фруктофуранозидаза, -галактозидаза) нашли применение в кондитерской и других отраслях пищевой промышленности. Широко используют как в пищевой, так и микробиологической отраслях дрожжевые гидролизаты и автолизаты. Некоторые компоненты дрожжевых клеток (полисахариды, РНК и др.) применяют в качестве лечебных препаратов.
В дрожжевом производстве самыми значительными являются процессы, связанные с жизнедеятельностью дрожжей на стадии их выращивания. Поэтому для наиболее эффективного управления технологическим процессом необходимо знание биологии дрожжей, влияния внешних факторов на рост и развитие их клеток, на обмен веществ, биосинтез продуктов метаболизма.
1.1. Строение дрожжевой клетки
Клетки дрожжей имеют разнообразную форму: круглую, овальную, эллиптическую, лимоноподобную. По сравнению с клетками других микроорганизмов дрожжи имеют довольно крупные размеры: от 2,5 до 7 мкм в поперечнике и от 4,0 до 14 мкм в длину.
Дрожжевая клетка имеет сложное строение и состав, она содержит компоненты, которые подразделяются на органеллы и включения. К органеллам относится клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма и входящие в нее структуры – митохондрии, вакуоли, аппарат Гольджи, ядро (рис. 1.2).
Включения – это временные образования клетки (гликоген, трегалоза, жир, метахроматин и др.), которые появляются и исчезают в процессе обмена веществ.
Рис.1.2.Строение дрожжевой клетки (схема):
1– цитоплазматическая мембрана; 2 – цитоплазма; 3 – эндоплазматическая сеть; 4 – жировые включения (липиды); 5 – митохондрия; 6 – ядро; 7 – ядрышко; 8 – вакуоль; 9 – метахроматин (волютин); 10 – рибосомы; 11 – клеточная стенка; 12 – родовой рубец; 13 – гликоген
Клеточная стенка (оболочка) представляет собой жесткую структуру толщиной 25 нм, составляющую около 25 % сухого веса клетки. Плотная, тонкая и эластичная клеточная стенка окружает цитоплазму и придает характерную форму клетке дрожжей, защищает ее от вредных факторов среды, несет электрический заряд. Клеточная стенка поддерживает внутриклеточное осмотическое давление (5–20 МПа), регулируя поступление в клетку солей и других низкомолекулярных соединений. Осмотическое давление в клетке определяется содержанием воды, которая в этом случае играет механическую роль, поддерживая тургор клеток. Это одна из важнейших функций воды в живых организмах.
В химический состав клеточной стенки входят белково-поли-сахаридные комплексы, фосфаты и липиды. Полисахаридная часть комплекса состоит примерно из равных количеств глюкана и маннана, сумма которых составляет около 90 % от сухой массы стенки, остальное количество ее приходится на долю белка, липидов и гюкозамина. Глюкан, вероятно, является основным структурным компонентом клеточной стенки, поскольку при его удалении она полностью разрушается. Маннан находится главным образом во внешних слоях клеточной стенки. Третий углеводный компонент клеточной стенки – хитин – представляет собой полимер N-ацетилглюкозамина, он обнаруживается в участках, ассоциированных с дочерними шрамами. Эти шрамы в обычном микроскопе не видны, их можно рассмотреть с помощью люминесцентного микроскопа после окрашивания клеток флуоресцентными красителями (рис.1.3). На одном и том же месте клеточной стенки дрожжей никогда не появляются две почки. Каждый раз почка оставляет новый дочерний шрам на стенке материнской клетки. По количеству дочерних шрамов можно судить о возрасте клетки. Выделение дочерних шрамов с помощью обработки клеточной стенки литическими ферментами показало, что хитин образует кольцо вокруг дочернего шрама.
Белок составляет 10–13 % сухого веса клеточной стенки, часть его находится в виде связанных со стенкой ферментов. У дрожжей описано несколько таких ферментов, в том числе инвертаза, щелочная фосфатаза и липаза, а также глюканаза и маннаназа –два фермента, которые участвуют в размягчении клеточной стенки, способствуя формированию почек. Белковые комплексы насыщены также дисульфидными и сульфгидрильными группами.
Липиды в основном состоят из свободных жирных кислот (олеиновой, пальмитолеиновой, пальметиновой и стеариновой); остальную часть их представляют триглицериды, стерины фосфолипиды.
Рис. 1.3. Клетки дрожжей, окрашенные флуорохромным красителем примулином (люминесцентный микроскоп). Видны рубцы дочерних шрамов – светящиеся круги
Клеточная или цитоплазматическая мембрана (плазмалемма) дрожжевой клетки располагается сразу же за клеточной стенкой, тесно прилегая к ее внутренней поверхности. Плазмалемма состоит примерно из равного количества липидов и белков и из небольшого количества углеводов (рис.1.4). Липиды представлены в основном моно-, ди-, и триглицеридами и стеролами – эргостеролом и зимостеролом. В состав белков плазмалеммы входят ферменты, принимающие участие в усвоении сахаров и аминокислот.
Рис. 1.4. Глобулярная структура биомембраны дрожжей: 1 – белок; 2 – белковый комплекс; 3 – двойной слой липидов (стрелки указывают на изменение положения белков)
Цитоплазматическая мембрана осуществляет важнейшие функции клетки: действует как осмотический барьер, регулируя поступление питательных веществ из раствора в клетку и удаление продуктов обмена веществ, осуществляет биосинтез некоторых составных частей клетки (компонентов клеточной стенки), представляет собой место локализации некоторых ферментов и органелл (рибосомы). В мембранах локализованы участки инициации синтеза ДНК, цепи электронного транспорта, ферменты сопряжения окисления с фосфорилированием. Вблизи мембраны находятся ферменты окисления жиров, трикарбоновых кислот и т. д. На наружной стороне мембран расположены ферменты гликолиза, протеолиза, эстеразы и др. Плазмалемма участвует также в регуляции построения мультиэнзимных комплексов, включающих систему ионов натрия и калия, активируемую АТФ.
Транспорт различных субстратов в клетку связан с изменением проницаемости мембраны, которая в свою очередь зависит от активности фосфолипазы и липазы. Липидный состав цитоплазматической мембраны регулирует поступление в клетку многих веществ в зависимости от их растворимости в липидах и степени диссоциации. Анаэробиоз способствует увеличению содержания в мембране нейтральных липидов и насыщенных жирных кислот, аэробные условия – повышению уровня ненасыщенных жирных кислот (пальмитолеиновой и олеиновой) и эргостерола. Изменения липидного состава мембраны оказывают воздействие на осмотические свойства, температурную чувствительность клетки и поглощение ею растворенных веществ.
Цитоплазма представляет собой коллоидную систему, состоящую из белков, аминокислот, рибонуклеиновых кислот, углеводов, липидов, минеральных веществ, воды и низкомолекулярных соединений. Структура цитоплазмы изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста клетки.
Цитоплазма клетки дрожжей содержит следующие структуры: ядро, митохондрии, рибосомы, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум (ЭПР), лизосомы, вакуоли. Они принимают активное участие в осуществлении важных ферментативных процессов в цитоплазме, например, первая стадия дыхания – гликолиз и спиртовое брожение – протекает в цитоплазме, а последующий этап – цикл трикарбоновых кислот – в митохондриях.
Рибосомы – ультрамикроскопические плотные сферические гранулы рибонуклепротеидной природы, которые содержат почти равное количество РНК и белка, а также незначительное количество липидов, связанных между собой в виде надмолекулярного комплекса. С функциональной особенностью рибосом связан синтез клеточных белков и ферментов, в них происходит конденсация аминокислот и укладка их в полипептидную цепь в соответствии с генетической информацией, переданной из ядра через информационную РНК. Рибосомы расположены в цитоплазме свободно в виде полисом, состоящих из 5–6 рибосом, или большей частью связаны с внешней поверхностью мембран эндоплазматической сети, где они располагаются рядами.
Ядро является постоянным структурным компонентом дрожжевой клетки, в нем создается вся клеточная генетическая информация, закодированная в ДНК хромосомы. Внутреннее коллоидное содержимое ядра – нуклеоплазма – отделено от цитоплазмы клетки двухмембранной оболочкой – нуклеолеммой, соединяющейся с другими мембранными структурами клетки. Оболочка принимает участие в регуляции внутриядерных процессов путем изменения проницаемости и непосредственных сообщений между ядром и внеклеточной средой, ядром и цитоплазмой. Ядро контролирует и регулирует процессы роста и размножения, метаболизма клетки, синтез белков, липопротеидов и других соединений, образование и деструкцию большинства органелл. Повреждение ядра приводит к гибели клетки.
Основным химическим ингредиентом ядра является ДНК, с которой связана передача генетической информации от одного поколения клеток к другому. В состав ядра обязательно также входит РНК, но обычно в меньшем количестве, чем ДНК. Ядро содержит и белки, не связанные с нуклеиновыми кислотами. Молекулами ДНК и РНК обусловливаются синтез и особенности белка (рис. 1.5).
Рис. 1.5. Ядра (светлые участки) в клетках дрожжей, окрашенных флуорохромным красителем акридиновым оранжевым (люминесцентный микроскоп)
Содержание ДНК в любой клетке или в организме строго постоянно и не зависит от условий внешней среды, от питания или воздействия различных факторов, влияющих на метаболизм клетки. При размножении клеток в ядрах обнаруживают структуры, содержащие ДНК – хромосомы. Для конкретного вида дрожжей число хромосом, их размеры и форма постоянны. Так, у гаплоидных клеток дрожжей S. сerevisiae число хромосом равно 17.
В определенных условиях в природе или при воздействии различных физических и химических агентов число хромосом в клетке может измениться. Так, если в гаплоидных клетках набор хромосом одинарный, в диплоидных – двойной. С увеличением числа хромосомных наборов возрастает содержание ДНК, увеличиваются размеры клетки, ее ядра и ядрышка.
Митохондрии – это высокоспециализированные обязательные органеллы дрожжевой клетки. Они отделены от цитоплазмы двойной мембраной, которая по всему объему митохондрии образует складки, или кристы, выступающие внутрь этих органелл. Кристы в значительной степени увеличивают внутреннюю поверхность, на которой располагаются ферменты (рис. 1.6).
а
б
Рис. 1.6. Схема строения митохондрии: a, б – общая схема строения; в – схема грибовидных тел внутренних мембран; 1, 3 – наружная и внутренняя мембраны; 2 – межмембранное пространство; 4 – матрикс; 5 – кристы; 6 – головка; 7 – стержень; 8 – базальная пластинка (мембрана)
Ферменты митохондрий обеспечивают выполнение основной энергетической функции окисление субстрата в цикле Кребса, перенос электронов через дыхательную цепь и окислительное фосфорилирование. На поверхности внутренней мембраны, в том числе и на кристах, локализованы ферменты, участвующие в транспорте электронов и окислительном фосфорилировании. На поверхности внешней мембраны осуществляются окислительные реакции трикарбоновых кислот (цикл Кребса) и окисление жирных кислот. В результате деятельности митохондрий на каждую пару электронов образуются три молекулы АТФ – уникальных источников энергии для жизненных процессов в клетке. Митохондрии также участвуют в сложном механизме воспроизведения митохондриальной ДНК, транскрипции и трансляции генетической информации, в биосинтезе фосфолипидов, стеринов, в активации жирных кислот др. ДНК и РНК составляют количественно небольшой структурный компонент митохондрий.
На развитие митохондрий оказывает влияние содержание кислорода, наличие липидов и уровень глюкозы в среде. Так, в клетках дрожжей, перенесенных из аэробных условий в анаэробные, митохондрии теряют выраженную форму, и образуются мембраны неопределенной конфигурации (рис. 1.7).
Рис. 1.7. Митохондрии (светлые точки) в клетках дрожжей, окрашенных флуорохромным красителем аурофосфином (люминесцентный микроскоп)
Аппарат Гольджи состоит из ряда двойных мембран, концентрически изогнутых. Иногда от концов мембран отделяются круглые пузырьки, которые могут затем превращаться в крупные вакуоли. Функции аппарата Гольджи заключаются в управлении общим ходом физиологических процессов: транспорт секретируемых веществ в другие участки клетки и к ее поверхности, участие в образовании новых структурных элементов, обеспечение защитных функций. В аппарате Гольджи локализованы ферменты, катализирующие разрушение биополимеров. Аппарат Гольджи служит для секреции продуктов метаболизма клетки. Мембраны аппарата являются местом образования лизосом.
Цитоплазма клетки содержит систему двойных мембран, известную как эндоплазматический ретикулум, имеющую гранулярную или гладкую структуру. Тесный контакт ретикулума с другими компонентами клетки позволяет ему выполнять важную роль в обменных процессах клетки. Функция эндоплазматического ретикулума заключается в обеспечении транспорта различных веществ (белков, углеводов) по клетке. ЭПР разделяет цитоплазму на множество отсеков, благодаря чему химические реакции в клетке протекают строго упорядоченно. Мембраны представляют собой большие активные поверхности, на которых локализуются различные ферментные системы.
Вакуоли в дрожжевых клетках являются обязательным органоидом, заполненным клеточным соком, они являются производными ЭПР или аппарата Гольджи. Вакуоли являются структурой, изолирующей продукты распада и аккумулирующей чужеродные токсические вещества. Кроме растворенных в воде электролитов, в вакуолях содержатся в коллоидном состоянии белки, жиры, углеводы и полифосфаты. В вакуолях локализованы многие гидролитические ферменты, что свидетельствует о протекании в них гидролитических процессов, а также Na, K, Cа, Mg, Cl, SO4 и PO4 в виде отдельных элементов и солей, причем концентрация их во много раз превышает содержание солей в окружающей среде. Вакуоль, возможно, действует как резервуар для хранения питательных веществ и гидролитических ферментов. Вакуоли участвуют в осмотической регуляции и являются местом различных окислительно-восстановительных процессов.
Размеры и форма вакуолей в дрожжевых клетках подвержены значительным изменениям: в одной клетке их может быть несколько или одна – центральная. В тот момент клеточного цикла, когда начинается образование почки, крупная вакуоль, видимо, дробится на более мелкие, которые распределяются между материнской клеткой и почкой. В дальнейшем эти маленькие вакуоли снова сливаются, образуя в материнской и дочерней клетках по одной вакуоли (рис. 1.8).
а
б
Рис. 1.8. Клетки дрожжей с круглыми (а) и фрагментированными (б) вакуолями
Лизосомы представляют собой электронно-плотные гранулы, которые отделены от цитоплазмы однослойной липопротеидной мембраной. Они защищают клетку от повреждений продуктами распада и чужеродными агентами.
Внутриклеточные включения и запасные вещества, находящиеся в цитоплазме и вакуолях клеток в процессе их жизнедеятельности, – это морфологически дифференцированные образования гранул гликогена, капель жира и жироподобных веществ, метахроматина (волютина), скоплений серы, кристаллов кислот и сахаров.
Трегалоза (нередуцирующий дисахарид) и гликоген (полисахарид) могут содержаться в клетках в значительных пределах: трегалоза – от 20 до 150 мг, гликоген – от 30 до 300 мг на 1 г сухого вещества клеток. Гликоген представляет собой включения, образующие в цитоплазме большие гранулы, которые можно выявить с помощью раствора Люголя (рис. 1.9). На содержание в клетках этих углеводов оказывают значительное влияние условия культивирования дрожжей. Так, в дрожжах, выращенных в аэробных условиях, преобладает трегалоза, в анаэробных условиях – гликоген. Кроме того, повышение температуры среды, снижение содержания в ней азота способствует увеличению количества в клетках трегалозы и уменьшению количества гликогена.
а
б
Рис. 1.9. Гликоген в дрожжах, выращенных в аэробных (а) и анаэробных (б) условиях (окраска раствором Люголя)
Липиды (жиры и жироподобные вещества), являясь важными компонентами цитоплазматических мембран клетки, выполняют функцию запасного питательного материала. Жиры дрожжей представляют собой смесь истинных жиров (глицеридов жирных кислот) с фосфолипидами (лецитин, кефалин) и стеролами (эргостеролом). Фосфолипиды наряду со стеринами, каротиноидами и скваленами способствуют росту дрожжей и осуществлению биосинтетических реакций в анаэробных условиях. Капли жира видны под микроскопом в живых клетках благодаря способности сильно преломлять свет (рис. 1.10).
Рис. 1.10. Липидные включения в клетках хлебопекарных дрожжей в виде темных точек
Метахроматин (волютин) находится в состоянии коллоидного раствора в вакуолях. Гранулы волютина состоят из комплекса РНК, белка и липидов. В центре гранулы располагаются кислота и солерастворимые полифосфаты, связанные с РНК ионами Mg2+ и Са2+, которые стабилизируют эту структуру. Метахроматин является источником фосфора, аккумулятором энергии, необходимой при биосинтетических процессах. Его количество уменьшается при активных синтетических процессах и увеличивается со снижением активности размножения (рис. 1.11).
Рис.1.11. Волютин в клетках дрожжей, окрашенных метиленовой синью по Майеру