3.1. Количество почкующихся клеток
Этот показатель является одним из главных в оценке физиологического состояния размножающихся дрожжей. Так, в анаэробных и слабо аэробных условиях культивирования численность почкующихся клеток в течение первой части процесса составляет 80–100% и лишь к концу снижается до 30–40% от общего количества клеток. В условиях интенсивной аэрации питательной среды максимальный уровень почкующихся клеток значительно ниже (60–70%), и достигается он обычно во время второго или третьего часа выращивания, после чего медленно снижается. Повышение содержания почкующихся клеток в этих условиях свидетельствует об избытке углеводного питания в среде и использовании его дрожжами на брожение, что приводит к снижению выхода дрожжей (рис. 3.2).
а
Рис. 3.2. Клетки без почек (а) и почкующиеся (б)
В конце культивирования в этих стадиях количество почкующихся клеток не должно превышать 10 %, при более высоком содержании таких клеток стойкость (длительность сохранения бродильной активности) готовой продукции будет снижена вследствие незначительного уровня в ней резервных углеводов, в частности трегалозы. Кроме того, дрожжи чистой и естественно-чистой культуры будут иметь невысокую репродуктивную активность.
Если содержание почкующихся клеток в период активного роста дрожжей в стадиях с притоком питательной среды составляет 40–50 % и ниже, это свидетельствует о торможении активности размножения, вызванного одной из следующих причин: значительным повышением температуры в ферментере, снижением интенсивности аэрации, недостатком биостимуляторов, наличием ингибирующих веществ в среде, значительной инфицированностью. В этом случае следует выявить причины, по которым произошли нарушения процесса и устранить их. При обнаружении в среде культивирования бактерий необходимо снизить величину рН среды до 4,0–3,5 (с помощью серной кислоты).
3.2. Размеры дрожжевых клеток
Процентное соотношение крупных и мелких клеток также является важным показателем физиологического состояния размножающихся дрожжей. Так, если в популяции дрожжей анаэробной или слабо аэробной стадий содержится 70–80 % крупных клеток, то в аэробных условиях этот показатель не должен превышать 40–60 %. Размеры клеток возрастают, в основном, при повышении концент-рации сахара в питательной среде и использовании его дрожжами не только на построение биомассы, но и на аэробное брожение. Укрупнению клеток способствует также культивирование дрожжей при повышенной температуре либо в условиях недостаточной аэрации.
Количество мелких клеток в оптимальных условиях культивирования не должно превышать 5–10 % и лишь в конце процесса может достигать 15 %. Увеличение количества мелких клеток в начале или середине процесса свидетельствует о таких нарушениях технологии, как снижение интенсивности аэрации или недостаток одного из следующих минеральных компонентов: азота, фосфора, магния (рис. 3.3).
Рис. 3.3. Культура дрожжей со значительным количеством мелких клеток
Размеры клеток измеряют при помощи окулярного микрометра (1 мм состоит из 10 делений). Его помещают в диафрагму окуляра. Применяют также специальные винтовые окулярные микрометры.
Для определения истинной величины клеток необходим поправочный коэффициент, который устанавливают с помощью объектного микрометра с делениями 1 мм на 100 частей (одно деление равно 10 мкм). Объектный микрометр помещают на столик микроскопа и определяют, сколько окулярных и объектных делений помещается на отрезке от окулярного нуля до ближайшего совпадения черточек. В данном случае одно деление окулярного микрометра равно 4 мкм (20 : 5) – рис. 3.4.
а
в
в
Рис. 3.4. Объектный микрометр: а – общий вид; б – шкала; в – определение цены деления окулярного микрометра
При микроскопировании препарата дрожжей с тем же объективом и окуляром, при котором определяли поправочный коэффициент, измеряют длину и ширину клеток. Замеряют обычно 50–100 клеток, затем средний показатель умножают на поправочный коэффициент. При определении величины клеток отмечают их минимальные, максимальные и средние размеры.
Для облегчения работы можно пользоваться не объектным микрометром, а окулярным микрометром, определяя цену деления его шкалы при использовании различных окуляров и объективов по табл. 3.1.
Таблица 3.1
|
Окуляр |
Объектив |
Общее увеличение |
Цена деления шкалы окулярного микрометра, мкм |
|
7 |
8 |
56 |
21,3 |
|
7 |
20 |
140 |
8,5 |
|
7 |
40 |
280 |
4,2 |
|
10 |
8 |
80 |
17,2 |
|
10 |
20 |
200 |
6,9 |
|
10 |
40 |
400 |
3,4 |
|
15 |
8 |
120 |
15,0 |
|
15 |
20 |
300 |
6,0 |
|
15 |
40 |
600 |
3,0 |