
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
В отличие от бактерий одним из первых ответов клеток животных на тяжелые повреждения ДНК является массированная полимеризация остатков ADP-рибозы специальным ферментом – полимеразой поли(ADP-рибозы) (poly(ADP-ribose polymerase) – PARP). В ядрах клеток млекопитающих PARP присутствует в количестве 106 копий, и она обнаружена у большинства эукариот за исключением дрожжей. Процесс синтеза поли(ADP-рибозы) предшествует началу репарации повреждений ДНК. Большие затраты энергии на биосинтез этого полимера указывают на его важную, хотя и до конца не понятную, роль в выходе ядер клеток из стрессового состояния, вызванного премутационными повреждениями ДНК.
In vivo поли(ADP-рибоза) характеризуется очень малым временем полужизни. Цепи полимера, синтезированные в ядрах в ответ на мутагенное воздействие, в основном распадаются уже через 1–2 мин после завершения их синтеза. Такой быстрый обмен полимера в ядрах становится возможным благодаря совместному действию двух ферментов – PARP и гликозилазы поли(ADP-рибозы). Экспрессия PARP-кДНК в ядрах дрожжей, у которых отсутствуют оба фермента, летальна для клеток. Это связано, главным образом, с тем, что внутриядерное накопление поли(ADP-рибозы) сопровождается подавлением репликации ДНК и транскрипции.
Ген PARP, картированный на участке 1q41–1q42 хромосомы человека, кодирует полипептид, состоящий из двух функционально различающихся частей: N-концевого ДНК-связывающего и C-концевого каталитического доменов. Первый домен содержит две структуры типа "цинковые пальцы", которые обеспечивают взаимодействие PARP с разрывами в ДНК. С помощью футпринтинга установлено, что PARP связывается преимущественно с одноцепочечными разрывами ДНК, закрывая своей полипептидной цепью по семь–восемь нуклеотидов по обе стороны от разрыва. При этом PARP индуцирует образование V-образного изгиба ДНК в месте одноцепочечного разрыва. Для синтеза поли(ADP-рибозы) фермент использует NAD в качестве субстрата. Структурные аналоги NAD часто являются ингибиторами PARP, например 3-аминобензамид – один из самых эффективных ингибиторов PARP. Каталитический домен PARP обнаруживает гомологию с различными NAD-связывающими ферментами. Одноцепочечные разрывы, остающиеся между фрагментами Оказаки при синтезе отстающей цепи ДНК, не индуцируют образование поли(ADP-рибозы), вероятно, из-за их экранирования белками реплисомы.
Рис. I.61. Схематическое изображение молекулы поли(ADP-рибозы), присоединенной к полипептидной цепи полимеразы поли(ADP-рибозы) и продуктов ее деградации
Синтез поли(ADP-рибозы) можно рассматривать как один из редких случаев посттрансляционной модификации белков, при которой PARP использует свою собственную полипептидную цепь в качестве субстрата (рис. I.61). Такая массированная аутомодификация резко изменяет физические свойства фермента. Остатки Glu (25–30), расположенные в полипептидной цепи PARP между двумя вышеупомянутыми доменами, служат точками инициации синтеза поли(ADP-рибозы). В процессе синтеза происходит разветвление полимера, и длина боковых цепей может достигать нескольких сотен остатков. В настоящее время до конца неизвестно, модифицирует ли молекула PARP сама себя или же это осуществляют другие молекулы PARP. На основании имеющихся кинетических данных наиболее вероятной считается модель, в соответствии с которой молекула PARP, ассоциированная с одноцепочечным разрывом, образует комплекс с другой молекулой и уже вторая молекула PARP служит акцептором полимеризуемой ADP-рибозы.
Гликогидролаза поли(ADP-рибозы) расщепляет цепи полимера с их концов, освобождая мономеры и олигомеры ADP-рибозы. Таким образом, в результате синтеза и деградации поли(ADP-рибозы) в ядрах образуются не только остатки никотинамида и ADP-рибозы, но и более сложные разветвленные продукты, состоящие из трех–четырех молекул мономера.
В присутствии ингибиторов PARP клетки животных становятся чрезвычайно чувствительными к действию алкилирующих агентов и ионизирующей радиации. Кроме того, в этом случае наблюдается повышенный уровень сестринских хроматидных обменов (СХО). Однако до сих пор нет доказательств прямого участия поли(ADP-рибозы) в репарации ДНК. Сверхэкспрессия рекомбинантного N-концевого домена PARP в клетках животных сопровождается теми же эффектами, что и действие ингибиторов PARP, в частности 3-аминобензамида. В неповрежденных клетках происходят дестабилизация генома и рост числа СХО. Опыты с трансгенными мышами, у которых ген PARP инактивирован в результате генного нокаута (см. раздел 10.3.4), показывают, что PARP-дефицитные мыши, тем не менее, здоровы и фертильны. Следовательно, PARP не играет существенной роли в пролиферации клеток, их дифференцировке и онтогенезе мыши. Клетки таких животных обладают нормальной способностью к эксцизионной репарации ДНК системами BER и NER. PARP-дефицитным мышам свойственны не совсем понятные физиологические дефекты, проявляющиеся в гиперплазии эпидермиса, вызванной повышенной пролиферацией кератиноцитов у старых особей, а также пониженной способностью тимоцитов к пролиферации после -облучения. Клетки панкреатических островков у PARP-дефицитных мышей обладают повышенной устойчивостью к цитотоксическому действию NO. Это может указывать на недостаток NAD, вызываемый повышенным синтезом поли(ADP-рибозы), как одну из причин цитотоксичности NO у нормальных животных.
В настоящее время предложено несколько моделей, объясняющих физиологическую роль PARP в клетках животных. Все они подчеркивают, что PARP не участвует прямо в эксцизионной репарации ДНК, но необходима для быстрой мобилизации ресурсов клеток при исправлении повреждений их генома. Способность ингибиторов PARP вызывать гиперчувствительность клеток к алкилирующим агентам и ионизирующей радиации позволяет рассматривать этот фермент в качестве удобной мишени в химиотерапии опухолей.
Рассмотренные в данной главе механизмы образования мутаций указывают на большое разнообразие путей повреждения генетической информации, заключенной в экспрессирующихся и временно молчащих генах. Эволюционное развитие животного и растительного мира противопоставило мутагенным воздействиям мощное противоядие в виде эффективных систем репарации ДНК. Тем не менее, из-за ошибок систем репарации и повреждения самих этих систем происходит необратимое накопление мутаций, приводящих к нарушениям метаболизма и развитию различных патологических состояний организма. В этой связи еще более эффективным средством защиты генетической информации является блокирование (инактивация) химических мутагенов на подступах к жизненно важным генетическим локусам. Именно такую нагрузку несут рассмотренные выше ферментные системы детоксикации ксенобиотиков. На мой взгляд, одной из функций поли(ADP)-рибозы в клетках, подвергнутых мутагенному воздействию, может быть очистка ядер от мутагенов, ковалентно взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, в том числе свободных радикалов, возникающих под действием ионизирующего излучения. Это соединение может играть роль чистильщика (scavenger) ядер от химических мутагенов и понижать их внутриядерную концентрацию через образование соответствующих аддуктов. Синтез поли(ADP)-рибозы является быстрым адаптивным ответом клеток в ответ на массированное мутагенное воздействие. Однако в естественных условиях существования организмов такие ситуации встречаются редко. В природных условиях, свободных от присутствия антропогенных экологических факторов, скорее имеется слабый мутагенный фон, постоянно окружающий информационные макромолекулы на протяжении всей жизни организма. В недавно разработанной модели альтруистичной ДНК (Л.И. Патрушев, 1997 г.) избыточные последовательности нуклеотидов эукариотической ДНК рассматриваются в качестве еще одной специфической системы защиты генетической информации, характерной для многоклеточных организмов. Далее будут представлены основные положения этой модели.