3. Особенности функционирования репликативной вилки эукариот

Механизмы репликации ДНК у высших эукариот менее изучены из-за их большей сложности. Основные результаты получены на модельной системе с ДНК вируса SV40, в которой процесс репликации исследовали в зараженных клетках человека, культивируемых in vitro. В этой системе вирусный белок, называемый Т-антигеном, выполняет многие функции, необходимые для репликации вирусной ДНК. Во-первых, он является белком-инициатором, необходимым для инициации репликации; во-вторых, он обладает ДНК-хеликазной активностью, т.е. расплетает цепи реплицируемой ДНК перед работающей ДНК-полимеразой, и, в-третьих, Т-антиген необходим для правильного взаимодействия с ДНК ферментного комплекса, синтезирующего праймеры (праймосомы). Тем не менее, вирус SV40 использует для репликации ДНК своей небольшой хромосомы и многие белки клетки-хозяина, что позволяет исследовать функционирование репликативного комплекса клеток человека в такой относительно простой системе.

У эукариот обнаружены шесть ДНК-полимераз, три из которых – ,  и  – непосредственно участвуют в репликации хромосомной ДНК (табл. I.17). Аминокислотные последовательности этих трех ферментов гомологичны друг другу и последовательности продукта гена 43 бактериофага Т4. Эукариотическая ДНК-праймаза в отличие от аналогичного белка прокариот образует постоянный комплекс с ДНК-полимеразой , роль которого, по-видимому, ограничивается синтезом праймеров при репликации обеих цепей ДНК.

Белок PCNA и фактор репликации C (RFС) также образуют стабильный комплекс с ДНК-полимеразой , а в определенных условиях стимулируют и активность ДНК-полимеразы . Во многих отношениях PCNA и RFС являются функциональными аналогами соответственно -белка и белков -комплекса E. coli (см. рис. I.46,б), и их роль в синтезе ведущей и отстающей цепей ДНК вируса SV40 хорошо известна. Механизмы репликации ДНК прокариот и эукариот существенно различаются в том отношении, что во втором случае синтез ведущей и отстающей цепей ДНК

Таблица I.16

Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот

ДНК-полимераза	Ген дрожжей	Гомолог E. coli	Молекулярные массы субъединиц, кДа	Биологические функции
	POL1	?	160–185	Синтез ведущей цепи геномной ДНК в репликативной вилке; в комплексе с праймазой обеспечение синтеза праймеров на обеих цепях ДНК
		Pol I	40	Заполнение брешей при эксцизионной репарации ДНК, участие в рекомбинации
	MIP1		140 (человек) 116 (дрожжи)	Репликация митохондриальной ДНК
	POL3	Pol III	125	Синтез отстающей цепи геномной ДНК в репликативной вилке
	POL2	Pol II (?)	210–230	Репарация ДНК, регуляция клеточного цикла (?)
	REV3 и REV7	Pol IV (DinB/P)	173 и 29	Синтез ДНК на поврежденной матрице при SOS-ответе
η	RAD30	DinB, UmuC	70	Синтез ДНК на поврежденной матрице, с включением остатков А напротив тиминовых димеров
Примечание. ?  гомологи неизвестны.

осуществляют разные ДНК-полимеразы ( и  соответственно), тогда как у E. coli обе цепи ДНК синтезируются димером ДНК-полимеразы III. ДНК-полимераза  проводит инициацию синтеза ведущей цепи в точках начала репликации, а ДНК-полимераза  осуществляет циклические реинициации синтеза фрагментов Оказаки, по-видимому, распознавая наличие 5’-концевого нуклеотида очередного праймера с последующей диссоциацией от матричной ДНК и присоединением к ней для реинициации синтеза следующего фрагмента Оказаки. Созревание фрагментов Оказаки у эукариот требует удаления РНК-затравок с помощью 5’3’-экзонуклеазы (белковые факторы FEN-1 или MF-1) и РНКазы H1, а также ковалентного соединения фрагментов друг с другом под действием ДНК-лигазы I.

Роль ДНК-полимеразы  в настоящее время не ясна. Возможно, этот фермент непосредственно участвует в репликации или в сопряженной с репликацией репарации повреждений ДНК, а также в регуляции клеточного цикла.

ДНК-полимераза  обнаружена в 1996 г. у дрожжей S. cerevisiae. При исследовании белков Rev3 и Rev7, которые необходимы для мутагенеза, индуцируемого в ответ на повреждения ДНК, оказалось, что их комплекс обладает ДНК-полимеразной активностью. Эта полимераза способна эффективно использовать в качестве матрицы ДНК, содержащую циклобутановые димеры. В таких условиях активность ДНК-полимеразы  составляет лишь 1% от активности ДНК-полимеразы .

ДНК-полимераза η, так же как и предыдущий фермент, участвует в SOS-ответе дрожжей на генотоксические воздействия. В присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов она осуществляет включение в строящуюся цепь ДНК напротив тиминовых димеров только правильных нуклеотидов (А). Подробнее о функциях бактериальных гомологов двух последних ДНК-полимераз в SOS-мутагенезе см. в разделе 5.1.2.