
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Трансляция в хлоропластах.
Хлоропласты являются органеллами клеток растений, осуществляющих процесс фотосинтеза – преобразование энергии квантов света в энергию макроэргических связей ATP. Так же как и митохондрии, хлоропласты обладают собственным геномом, представленным множественными копиями кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (хпДНК – ctDNA), длина которой обычно составляет ~150 т.п.о. Геном хлоропластов заключает в себе более 100 различных генов. В соответствии с теорией эндосимбиоза хлоропласты произошли от цианобактерии Anacystis nidulans (Synechococcus PCC6301), которая в ходе адаптации к внутриклеточному существованию передала основную часть своих генов хромосомам ядра клетки-хозяина. В результате образовавшийся хлоропласт стал зависимым от ядра в отношении биосинтеза импортируемых хлоропластных белков и генетического контроля экспрессии собственных генов. Как и митохондрии, хлоропласты обладают собственной системой транскрипции и трансляции, а также репликации хпДНК.
В отличие от митохондрий животных, система трансляции хлоропластов высоко гомологична системе бактерий и представлена 70S рибосомами, собственными тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазами, многочисленными факторами трансляции и т.п. Геном хлоропластов содержит гены всех рРНК (16S, 23S и 5S), которые кластеризованы и транскрибируются полицистронно. В большой субчастице рибосом хлоропластов рРНК 23S-типа часто представлена двумя или четырьмя фрагментами. Так, в рибосомах Chlamydomonas eugametos она представлена четырьмя фрагментами длиной 280 (α-фрагмент), 52 (β), 810 (γ) и 1720 (δ) нуклеотидов. Вторичная структура этих фрагментов практически идентична предсказанной структуре соответствующих участков 23S рРНК E. coli. На этом основании делается вывод, что физическая непрерывность молекулы 23S рРНК не существенна для ее функционирования.
70S рибосомы хлоропластов содержат ~60 рибосомных белков, что превышает их содержание (55 полипептидов) в рибосомах E. coli. Приблизительно 1/3 рибосомных белков кодируется хпДНК, а 2/3 – ядерным геномом. Рибосомы хлоропластов высших растений содержат, по крайней мере, пять белков, не имеющих гомологов в рибосомах E. coli.
Геномы хлоропластов, для которых определена полная первичная структура, содержат 27–35 потенциальных генов тРНК. При этом в геноме для кодирования полипептидов используются все теоретически возможные кодоны (61). Это приводит к ситуации, характерной и для митохондрий, – у хлоропластов отсутствует полный набор тРНК, необходимых для декодирования этих кодонов. В данном случае проблема, по-видимому, решается так же, как и у митохондрий: индивидуальные тРНКPro(UGG), тРНКAla(UGC) и тРНКArg(ACG) распознают по четыре кодона, которые кодируют каждую из аминокислот, акцептируемых соответствующими молекулами тРНК (в скобках представлены последовательности антикодонов тРНК).
Генетическая информация хпДНК во многих случаях редактируется на уровне мРНК (подробно о механизме см. раздел 2.2.2). В этом случае в результате запрограммированных замен нуклеотидов в мРНК происходит создание новых инициирующих и терминирующих кодонов, а также изменение их смысла. Лишь очень редко редактирование сопровождается синонимическими заменами нуклеотидов (без изменения смысла кодона). Редактирование является критическим событием в экспрессии генов хлоропластов, так как неотредактированные транскрипты не способны правильно транслироваться. Очень эффектным результатом редактирования предшественника мРНК хлоропластов является создание в результате двух замен нуклеотидов инициирующего и терминирующего кодонов с образованием новой открытой рамки считывания, т.е. фактически нового гена, посттранскрипционно. В хлоропластах кукурузы, табака и черной сосны, геномы которых полностью секвенированы, имеется соответственно 26, 32 и 26 сайтов редактирования.
Зрелые и функционально активные мРНК хлоропластов не обладают кэп-группами и не полиаденилированы на 3'-концах. Из 70 генов, кодирующих белки в хлоропластах табака, лишь пять транскрибируются моноцистронно. Полицистронные предшественники мРНК подвергаются эндонуклеазному процессингу с образованием моноцистронных матриц. Более того, искусственные дицистронные мРНК не транслируются в бесклеточных системах. На этом основании делается вывод, что в хлоропластах в синтезе белка участвуют моноцистронные мРНК.
Среди 79 исследованных генов, кодирующих белки в хлоропластах табака, 30 содержат SD-подобные последовательности в 20-нуклеотидном участке перед инициирующим кодоном. Остальные 49 транскриптов также содержат такие последовательности, но их положение не фиксировано на матрице. Мутационные изменения некоторых SD-подобных последовательностей снижают эффективность трансляции мутантных мРНК, что указывает на функциональную значимость этих участков мРНК. Детальное исследование 5'UTR мРНК гена psbA хлоропластов табака позволило идентифицировать цис-действующие регуляторные элементы, существенные для ее трансляции. Два из них – RBS1 (AAG) и RBS2 (UGAU), расположенные между нуклеотидами в положениях –11 и –9, –25 и –22 соответственно комплементарны 3'-концу 16S рРНК хлоропластов. Полагают, что они участвуют во взаимодействии 30S субчастицы рибосом с мРНК. AU-богатая последовательность, расположенная между ними (UAAAUAAA) и получившая название AU-бокса, также критична для трансляции. Возможно, с этой последовательностью взаимодействуют транс-действующие белковые факторы. На наличие таких факторов трансляции указывают многочисленные данные мутационного анализа Chlamydomonas.
Как и у бактерий, AUG является основным инициирующим кодоном мРНК хлоропластов и направляет включение в полипептидную цепь формилметионина. Информация о молекулярных механизмах отдельных этапов трансляции в хлоропластах еще не получена.