
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Редактирование рнк у животных и их вирусов
Организм, ткань |
Локализация |
РНК-субстрат |
Последствия редактирования |
Печень/кишечник крыс |
Ядро |
APOB-мРНК |
CU (CAAGluUAASTOP) |
Мозг человека и грызунов |
» |
мРНК рецепторов AMPA и KA |
AI (CAGGluCGGArg) |
Семенники человека, нормальные и опухолевые ткани крыс |
» |
мРНК опухоли Вилмса 1 |
UA (CUCLeuCCCPro) |
Мышцы человека |
? |
мРНК -галактозидазы |
UA (TTCPheTACTyr) |
Опухоли человека |
Ядро |
мРНК нейрофиброматоза типа 1 |
CU (CGAArgUGASTOP) |
Печень крыс |
» |
тРНКAsp |
CU и UC рядом с антикодоновой петлей |
Сумчатые |
Митохондрии |
тРНКGly |
CU в антикодоне (GlyAsp) |
Вирус гепатита |
Вирус |
Антигеномная РНК |
AI (UAGSTOPUGGTrp) |
Парамиксовирусы |
» |
Ген Р |
Вставки G |
Вирус Эбола |
» |
Ген гликопротеина |
Вставки А |
Рис. I.11. Экспрессия гена APOB человека и механизм редактирования его мРНК
а– схема экспрессии гена;б– механизм дезаминирования остатка C в APOB-мРНК в результате редактирования с участием эдитосомы;в– нарушение специфичности редактирования APOB-мРНК при олигомеризации каталитической субъединицы APOBEC1. В этих условиях субстратом для эдитосомы могут быть другие мРНК (мРНК Z)
мРНК длиной в семь т.о. В результате трансляции редактированных мРНК образуется укороченный ApoB48 (241 кДа), который содержит 2152 N-концевых аминокислотных остатка ApoB100. В функциональном отношении этот белок остается полностью активным, однако у него отсутствует С-концевой домен ApoB100, который отвечает за связывание с рецептором липопротеинов низкой плотности. Молекулярным механизмом редактирования ApoB-мРНК является сайт-специфическое дезаминирование цитозина с помощью цитидиндезаминазы. Недавно клонировали ген, кодирующий этот фермент у человека, и полностью определили его первичную структуру. Показано, что цитидиндезаминаза человека, осуществляющая редактирование ApoB-мРНК, представляет собой димер, построенный из двух идентичных субъединиц (АРОВЕС1) с молекулярной массой 28 кДа. Ген фермента, расположенный на хромосоме 12, экспрессируется исключительно в тонком кишечнике. Специфичность дезаминирования остатка цитозина определяется, по крайней мере, двумя факторами: последовательностью нуклеотидов мРНК в окрестностях этого сайта и белковыми кофакторами, взаимодействующими с каталитической субъединицей цитидиндезаминазы. Перенос методами генной инженерии последовательности нуклеотидов, фланкирующей сайт редактирования, в новые мРНК приводил к тому, что новые рекомбинантные РНК также подвергались специфическому редактированию in vivo и in vitro. В экспериментах такого рода, а также путем замен отдельных нуклеотидов методами направленного мутагенеза определили последовательность нуклеотидов мРНК, отвечающую за специфичность редактирования. Оказалось, что для оптимального осуществления этого процесса необходима последовательность длиной в 55 нуклеотидов, однако и 25 нуклеотидов в окрестностях сайта было достаточно, чтобы редактирование осуществлялось in vitro с 25%-ной эффективностью. Ниже представлены последовательности нуклеотидов в окрестностях сайтов редактирования, которые оказались высокогомологичными у разных видов млекопитающих.
С→U * * ** * * * * *
Человек Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Сайт 2 aAaA С AAUссaUGAUСuaсAUuUguuua
Бабуин Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Свинья Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Кролик Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Крыса Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAgAG
Мышь Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Звездочками обозначены нуклеотиды, замены которых с помощью направленного мутагенеза наиболее резко снижали эффективность редактирования, а строчными буквами отмечены негомологичные нуклеотиды. Подчеркнута последовательность нуклеотидов, получившая название якорной последовательности (mooring sequence). Эта последовательность является единственным цис-действующим регуляторным элементом, присутствие которого необходимо и достаточно для специфического редактирования вышерасположенного остатка С в экспериментах in vitro. Редактирование ApoB-мРНК здесь происходит после удаления из нее интронов в результате сплайсинга. Эффективность редактирования в таких системах зависит от нуклеотидных последовательностей в окрестностях этого сайта. В частности, АТ-богатые последовательности без выраженной вторичной структуры, фланкирующие якорную последовательность, стимулируют редактирование APOB-мРНК.
В связи с тем, что простая 11-звенная якорная последовательность определяет нуклеотид, который редактируется в этой системе, возникает вопрос о дополнительных факторах, которые требуются для обеспечения специфичности функционирования системы редактирования, зависимой от присутствия якорной последовательности. Действительно, перемещение якорной последовательности in vitro к любому остатку C на расстояние трех–четырех нуклеотидов от него в направлении 3’-конца РНК обеспечивает его редактирование in vivo. Предполагается, что в эдитосомах, осуществляющих редактирование ApoB-мРНК, соблюдается определенное соотношение между содержанием APOBEC1-субъединиц и дополнительных факторов-помощников (см. рис. I.11,б). В этой части рисунка показана гипотетическая структура нормальной эдитосомы, осуществляющей редактирование АРОВ-мРНК. Такая эдитосома включает собственно каталитический димер, два полипептида с молекулярными массами 66 и 44 кДа, необходимыми для специфического взаимодействия эдитосомы с якорной последовательностью, а также сопутствующие факторы Х, ассоциированные с белком AUX240 (240 кДа), который регулирует эффективность редактирования мРНК, обеспечивая сборку эдитосомы из белковых компонентов.
Сверхэкспрессия APOBEC1-субъединицы в клетках, достигаемая генно-инженерными методами, приводит к изменению специфичности редактирования. Это было объяснено нарушением стехиометрических соотношений между молекулами субъединиц и дополнительными факторами, обеспечивающими специфичность редактирования (см. рис. I.11,в). На рисунке показано, что избыток субъединицы АРОВЕС1 в эдитосоме стимулирует ее к редактированию вышерасположенных остатков С в АpoВ-мРНК, поскольку изменяется характер фолдинга 5’-концевой части редактируемой мРНК. В результате другие остатки С становятся доступными для каталитических субъединиц.
В соответствии с вышеизложенным, все известные в настоящее время формы редактирования пре-мРНК можно подразделить на два класса: инсерционное редактирование и редактирование с замещением. В первом случае редактирование мРНК сопровождается вставкой и/или удалением специфических нуклеотидов. Предполагается, что при такой форме редактирования последовательность нуклеотидов мРНК образует гибрид с gРНК, что сопровождается появлением неспаренных и ошибочно спаренных оснований, которые и маркируют сайты редактирования. Далее происходит расщепление углевод-фосфатного остова мРНК по этим сайтам в результате реакции трансэтерификации между фосфатными группами мРНК и встраиваемых нуклеотидов с последующим повторным лигированием образовавшихся фрагментов мРНК, сопровождаемым вставкой или удалением нуклеотидов. Такой механизм реализуется, по крайней мере, в митохондриях некоторых жгутиковых, а также слизневиков. У последних в результате редактирования митохондриальных мРНК имеют место вставки остатков С. Инсерционное редактирование мРНК парамиксовирусов, сопровождающееся вставками остатков G, по-видимому, происходит вследствие ошибок РНК-полимеразы при транскрипции соответствующих генов. В результате редактирования с замещением, как это имеет место в случае редактирования ApoB-мРНК, а также, возможно, мРНК митохондрий и хлоропластов высших растений и ионных каналов, не происходит расщепления фосфодиэфирных связей в редактируемой РНК, а новое азотистое основание синтезируется in situ (т.е. модифицируется непосредственно в ее полинуклеотидной цепи). При этом не используется gРНК. Формально такой механизм напоминает реакции посттранскрипционной модификации азотистых оснований в тРНК, рРНК, малых ядерных РНК, а также двухцепочечных РНК.
Каково же биологическое значение механизма редактирования генетической информации на уровне мРНК? Какие силы заставили этот механизм эволюционно закрепиться у большого числа далеко отстоящих друг от друга биологических видов? Почему для организмов выгоднее изменять информацию посттранскрипционно, а не заключать ее непосредственно в генах? Очевидно, что для этого должны быть веские, не вполне понятные сегодня причины, которые не допускают перехода к обычному кодированию такой информации. На мой взгляд, редактирование мРНК может иметь непосредственное отношение к дополнительной стабилизации генетической информации в наиболее уязвимых для мутагенеза генетических локусах. Действительно, редактирование РНК получило наибольшее распространение в хлоропластах и митохондриях высших организмов, а также у одноклеточных эукариот. В разделе 5.3.1 приводится обоснование того, что дополнительная защита генетической информации от разрушительного действия химических мутагенов особенно нужна именно многоклеточным организмам для предотвращения накопления генетического груза в делящихся соматических клетках при онтогенезе. Вероятно, одним из путей достижения этого было эволюционное включение в геном эукариот избыточных последовательностей нуклеотидов. У свободноживущих одноклеточных организмов на популяционном уровне такой проблемы не существует, поскольку гибель отдельной свободноживущей клетки не грозит существованию популяции этих клеток, как это имеет место у Metazoa. Однако у митохондрий и хлоропластов, часто рассматриваемых в качестве внутриклеточных микроорганизмов-эндосимбионтов, наблюдаются совершенно особые условия существования. Несмотря на то что их геном содержит мало избыточных последовательностей и, следовательно, слабо защищен ими от химических мутагенов, мутации в определенных генах митохондрий и хлоропластов могут быть летальными для соматической клетки-хозяина и всего многоклеточного организма. В этих условиях мутационное изменение нуклеотидов, подвергающихся редактированию на уровне РНК, фактически заменяет само редактирование, и такие мутации нейтральны в функциональном отношении. В отсутствие мутаций редактирование корректирует первичную структуру РНК, а при наличии их необходимость в редактировании отпадает. Иными словами, во всех этих локусах редактирование как бы упреждает мутационные замены редактируемых нуклеотидов в генах, которые геном по каким-то причинам не может эффективно предотвратить в силу особенностей структуры и функционирования соответствующих генетических локусов. По аналогии с неоднозначностью генетического кода наличие механизма редактирования допускает сосуществование в конкретных генетических локусах "вырожденных сайтов", различающихся по первичной структуре, но не своему генетическому смыслу.