6. Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии

Проведено сравнение эффективности рассмотренных выше систем экспрессии эукариотических рекомбинантных генов с использованием гена huLIF в качестве модели. In vivo этот белок с молекулярной массой 32–67 кДа в зависимости от источника получения синтезируется под контролем уникального гена, содержащего три экзона. Фрагмент кДНК, кодирующий зрелый процессированный huLIF, клонировали в составе трех векторов, структура которых изображена на рис. II.13,а–в. Для трансфекции клеток COS и CHO использовали одну и ту же конструкцию (см. рис. II.13,а). Оказалось, что все пять исследованных линий клеток обладали способностью к синтезу рекомбинантного huLIF, обладающего биологической активностью. В клетках линий CHO, Sp2/0 и MEL после проведения электрофореза продукт обнаруживали в виде отчетливой, хотя и широкой полосы. В то же время рекомбинантный белок в клетках, зараженных бакуловирусами, был представлен дискретными фракциями меньшей молекулярной массы, что указывало на его неполное гликозилирование. Рекомбинантный материал в клетках COS был представлен дисперсной фракцией с молекулярной массой 20–40 кДа, что интерпретировалось в пользу ограниченной способности этих клеток осуществлять процессинг сильно гликозилированных полипептидных цепей.

Стабильные клетки-продуценты, созданные на основе амплификации рекомбинантных генов, позволяют получать рекомбинантные продукты в более высоких титрах по сравнению с клетками, адаптированными к "быстрой" кратковременной экспрессии рекомбинантных белков (клетки MEL или COS). Для получения высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков во всех обсуждаемых системах необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры белка, который должен быть синтезирован, и конструировать экспрессирующие векторы в соответствии с требованиями, предъявляемыми теми или иными клетками. В ряде случаев предварительные исследования такого рода бывает удобнее провести в бесклеточных белоксинтезирующих системах, которые позволяют иногда получать даже препаративные количества рекомбинантных белков.

5. Бесклеточные белоксинтезирующие системы

Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, происходящих в живом организме, и во время функционирования воспроизводит некоторые существенные особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы часто используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, а также на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам.

Большим преимуществом бесклеточных систем перед целыми клетками является доступность их отдельных компонентов для экспериментальных воздействий. Такие системы позволяют исследовать влияние различных экзогенных факторов на их функционирование (ионные условия, рН, ингибиторы и активаторы и т.п). Кроме того, в бесклеточной системе можно легко заменять отдельные компоненты или непосредственно воздействовать на них в изолированном состоянии и затем по реакции системы познавать их функциональную значимость. Большинство результатов, полученных с помощью бесклеточных систем, невозможно было бы иметь при использовании живых клеток, так как последние при нарушении гомеостаза нередко гибнут. При этом бывает трудно определить, какой же компонент оказался критическим. К сожалению, перечисленные достоинства бесклеточных систем одновременно являются их слабым местом, поскольку после разрушения клеток безвозвратно исчезают те многочисленные взаимодействия между их компонентами, благодаря которым можно без труда отличить живую клетку от бесклеточного экстракта.

Бесклеточные белоксинтезирующие системы представляют собой одни из самых сложных и многокомпонентных систем in vitro, используемых в биохимии. Это связано с необходимостью воспроизведения в пробирке всех этапов биосинтеза белка, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. Тем не менее, уже более 30 лет удается успешно осуществлять процесс биосинтеза белка in vitro и использовать такие системы по трем основным направлениям: для анализа кодирующего потенциала нуклеиновых кислот, исследования механизмов биосинтеза белка и препаративной наработки некоторых рекомбинантных белков и пептидов.

По природе компонентов, которые определяют способность бесклеточных систем осуществлять трансляцию определенных мРНК, принято различать прокариотические и эукариотические системы. Естественно, что наиболее эффективная трансляция мРНК происходит в гомологичных бесклеточных системах. Однако под контролем гомологичных регуляторных элементов в бесклеточных системах могут быть успешно транслированы и чужеродные мРНК – транскрипты рекомбинантных генов.

В некоторых бесклеточных системах транслируют предварительно очищенную мРНК или используют эндогенную мРНК, присутствующую в полисомах. В других белоксинтезирующих системах – системах сопряженной транскрипции и трансляции, одновременно происходят синтез мРНК и ее трансляция рибосомами.

Из-за высокой стоимости очищенных компонентов в подавляющем большинстве случаев бесклеточные системы биосинтеза белка используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. Однако в последнее время разработаны проточные белоксинтезирующие системы, в которых процесс трансляции удается поддерживать длительное время, непрерывно подводя извне расходуемые вещества, с одновременным удалением синтезируемых белков и продуктов деградации компонентов системы. Основные принципы получения и функционирования всех разновидностей белоксинтезирующих систем будут рассмотрены ниже.