Лептоспіроз

Лептоспіроз (водна гарячка) - гостра зоонозна природно-вогнищева інфек­ційна хвороба, що викликається лептоспірами і супроводжується гарячкою, ура­женнями нирок, печінки, серцево-судинної і нервової систем, у тяжких випадках жовтяницею і геморагіями.

Всі патогенні лептоспіри об'єднані в один вид Leptospira interrogans, а сап­рофітні - в L. biflexa. Тепер відомо понад 200 сероварів лептоспір, які складають 38 серогруп. На території України виділяють 13 сероварів, з яких захворювання найчастіше викликають Leptospira incterohaemorrhagiaе, L. grippotyphosa, L. hebdomadis, L. canicova, L. pomona.

Резервуаром і джерелом збудника в природі є дикі гризуни (миші, полівки, ондатри) та домашні тварини (свині, корови, кози, коні, собаки). Зараження лю­дей відбувається через воду, контаміновану сечею хворих тварин та носіїв, або при догляді за хворою худобою.

Для лабораторної діагностики лептоспірозу використовують мікроскопічний, бактеріологічний, біологічний і серологічний методи дослідження.

Взяття і доставка досліджуваного матеріалу. Від хворого беруть кров, сечу, бронхоальвеолярні змиви, спинномозкову рідину (при наявності менінгеаль- них симптомів); від трупів - кров, ліквор, гомогенати внутрішніх органів. За епі­деміологічними показаннями досліджують воду, харчові продукти, гризунів на лептоспіроносійство, сечу домашніх тварин.

У перші дні захворювання, коли є гарячковий період, для посіву, постановки біопроби і первинної бактеріоскопії беруть кров; на 10-16-ий день хвороби - сечу і ліквор; на 5-15-ий день - досліджують сироватку крові на виявлення протилеп- тоспірозних антитіл. Виділення чистих культур і зараження тварин проводять у режимних лабораторіях, куди матеріали доставляють із великими пересторогами спеціальним нарочним. У звичайних мікробіологічних лабораторіях проводять лише бактеріоскопічні й серологічні дослідження.

Мікроскопічний метод. Лептоспіри погано забарвлюються аніліновими фар­бами, тому досліджують живі мікроорганізми в препаратах "надавленої краплі" за допомогою темнопольного мікроскопа з використанням сухого об'єктива (40х). Венозну кров в об'ємі 2 мл змішують із 2-ма мл 2 % розчину цитрату натрію. Отриману плазму центрифугують 30 хв при 3000 об/хв. Сечу, спинномозкову рідину і завись паренхіматозних органів центрифугують протягом 2-х год при 4000 об/хв. Пастерівською піпеткою або бактеріологічною петлею наносять краплю осаду на тонке предметне скло (1-1,1 мм), накривають покрівним скельцем. На верхню лінзу темнопольного конденсора наносять краплю дистильованої води, на яку кладуть препарат "надавленої краплі".

При мікроскопії виявляють тонкі рухливі лептоспіри з багатьма дрібними завитками і характерними заворотами на кінцях, що надає їм вигляду літери S (рис. 82). Щоб запобігти діагностичним помилкам, необхідно пам'ятати, що деякі артефакти (нитки фібрину, оболонки еритроцитів), які нагадують лептоспіри, не мають самостійного руху. Виявити збудників лептоспірозу за допомогою мікро­скопії можна лише у свіжому досліджуваному матеріалі.

Чутливість бактеріоскопічного методу - 10⁶ клітин/мл. Кількість мікроор­ганізмів у крові хворих під час лептоспіремії не перевищує 10⁴-10⁶ клітин/мл, тому діагностична цінність цього методу недостатня для виявлення збудників на ранніх стадіях хвороби. Надійніші результати дає метод імунофлуоресценції з викорис­танням специфічних люмінесцентних сироваток.

Якщо неможливо застосувати метод прямої мікроскопії нативних матеріалів, можна вдатися до забарвлення фіксованих мазків за Романовським-Гімзою або негативного контрастування конго червоним. Однак після такої обробки морфо­логія лептоспір змінюється, що може призвести до помилкових оцінок.

Бактеріологічний метод. Класичний метод виділення чистих культур леп­тоспір потребує складних живильних середовищ і багато часу - до 1-2-х місяців. Використовують рідкі середовища Фервольта-Вольфа, Уленгута, Терських, основ­ним компонентом яких є інактивована кроляча сироватка.

Кров, сечу, спинномозкову рідину сіють по 10-20 крапель у 3-5 пробірок із середовищем. Посіви інкубуюгь при температурі 28­30 °С. Лептоспіри розмножуються дуже повільно і не викликають помутніння середовища. Тому для ви­явлення їх росту через 7-10 днів інкубації з кожної пробірки виготовляють препарат "надавленої краплі" і мікроскопують у темному полі. Якщо ріст лептоспір не виявляють, посіви продовжують вирощувати в термостаті й мікроскопують через кожні 7-10 днів. При відсутності росту протягом 3-х місяців видають негативний результат.

При виявленні лептоспір у будь-якій пробірці необхідно зробити пересів на свіже середовище для _{Рис Н1 Лептоспіри в} темному збереження культури з метою її ідентифікації. _полі _зору.

Встановлення виду і серовару лептоспір проводять за допомогою реакції аг­лютинації і лізису з типовими діагностичними сироватками. Частота виділення культур коливається від 29 до 48 %.

Сучасна методика полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), яка грунтується на високій специфічності множення in vitro послідовності селективної ДНК, вияв­ляє лептоспір у перші дні хвороби, навіть якщо їх кількість незначна (1-10 клі- тин/мл). Постановка ПЛР із застосуванням довільних праймерів дозволяє дифе­ренціювати збудників на внутрішньовидовому і субсероварному рівнях. Для іден­тифікації лептоспір за цією методикою потрібно всього 10-12 год. Особливо показана реакція для виявлення збудників в сечі. ПЛР виявилась позитивною в 94,4 % випадків.

Лептоспіри в досліджуваному матеріалі можна виявити за допомогою мето­ду прямого імуноферментного аналізу. Тепер для ІФА розроблено і впроваджено в практику високоефективний родоспецифічний діагностикум - пероксидазний анти - Patos 1-кон'югат. Чутливість методу - 1,5-10⁴ клітин/мл. Результат видають через 24 год від початку дослідження.

Біологічний метод. У випадках забруднення досліджуваного матеріалу сто­ронньою мікрофлорою (сеча, вода, грунт, харчові продукти тощо) проводять зара­ження гвінейських свинок і золотистих хом'ячків. Матеріал вводять внутрішньо- очеревинно або в скарифіковану шкіру подушечок задніх лапок. До L. icterohae- morrhagiae особливо чутливі гвінейські свинки. Через 5-7 днів після зараження у них виникає гарячка, жовтяничне забарвлення склер і слизових оболонок, крово­виливи в органи і тканини. Лептоспіри виявляють у нирках, печінці, легенях ме­тодом темнопольної мікроскопії.

Для зараження іншими сероварами лептоспір найбільш придатні золотисті хом 'ячки, яким матеріал вводять підшкірно, внутрішньошкірно, в черевну порож­нину або у вену. Після загибелі тварин від них виділяють чисту культуру та іден­тифікують її за допомогою реакції аглютинації і лізису.

При відсутності золотистих хом'ячків заражають молодих цуценят, у яких розвивається хронічний процес, що триває декілька місяців. Лептоспіри легко виявити в сечі тварин.

Серологічні дослідження. У практичних лабораторіях найчастіше застосовують реакцію мікроаглютинації і лізису лептоспір (РМАЛ). Для її постановки викорис­товують живі культури лептоспір 5-12-денного вирощування зі щільністю 50-100 клітин у полі зору. Лептоспіри повинні рухатись без спонтанної аглютинації. Для постановки РМАЛ рекомендовані ВООЗ стандартні культури 13 серогруп, окрім то­го, беруть і діагностичні штами українського походження. Реакцію ставлять в аглю- тинаційних пробірках або в лунках планшет за стандартною методикою (табл. 64).

Облік реакції аглютинації проводять шляхом виготовлення з кожної пробірки препарату "надавленої краплі" й дослідженні її під мікроскопом у темному полі зору. При цьому слід розрізняти феномени лізису і аглютинації, які настають од - ночасно. Лізис характеризується набряком, зернистістю лептоспір і втратою рух­ливості. Зернисті лептоспіри склеюються по 3-8 особин, які тут же розпадаються

Таблиця 64 Схема постановки реакції аглютинації і лізису лептоспір Компоненти, мл	Номер пробірки
	1	2	3	4	5	6	7 (контр.)
Ізотонічний розчин хлориду натрію	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Сироватка хворого 1:25	0,2 ^	^	^	^	^		-
Розведення сироватки	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	-
Культура живих лептоспір	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Експозиція 60 хв при 37 °С або при 25 °С

на окремі зерна, які пізніше лізуються повністю. Лізис відбувається в перших про­бірках із меншими розведеннями сироватки. Феномен аглютинації виглядає в полі зору як утворення клубків ("павучків"), тобто склеювання лептоспір між собою. Він спостерігається в наступних пробірках із більшими розведеннями сироватки. Діагностичний титр реакції становить 1:100 і більше для лізису, 1:400-1:1600 і більше для аглютинації. Реакцію необхідно ставити повторно методом парних сироваток для визначення наростання титру антитіл.

Для визначення специфічних антитіл використовують також хімічно стабільні мікрокапсули з адсорбованими на еритроцитах барана антигенами лептоспір. Показники мікрокапсульного аглютинаційного тесту у 5-8 разів вищі, ніж в РМАЛ. Антитіла за допомогою цього високоспецифічного тесту можна виявити на 1-3-й дні хвороби.

Почали широко використовувати і реакцію непрямої гемаглютинації з відпо­відними родоспецифічними і серогрупоспецифічними еритроцитарними діагнос- тикумами.

Останнім часом запропоновано реакцію латекс-аглютинації з ліпополісаха- ридним стандартним латексним Ротопа-діагностикумом.

Більш чутливий метод непрямого імуноферментного аналізу. За його допо­могою протилептоспірозні антитіла в діагностичному титрі виявляються на 5-й день хвороби. Виготовлені діагностичні тест-системи для визначення антитіл, де як фермент використані пеніциліназа або каталаза, які мають перевагу порівняно з пероксидазою хрону.

Можна використати як скринінг на антитіла до багатьох сероварів лептоспір метод зустрічного імуноелектрофорезу.

Для визначення протилептоспірозних антитіл застосовують і РЗК. Вона ви- сокоспецифічна, чутлива, антитіла в ній виявляються раніше, ніж в реакції мікро- аглютинації і лізису. Антигеном є метанолові екстракти з L. interrogans, сероварів icterohaemorrhagiae, canicola та L. biflexa.

Бореліози

До бореліозів відноситься ряд самостійних нозологічних форм захворюван­ня, що викликаються спірохетами роду Borrelia: поворотний тиф, кліщова пово­ротна гарячка і хвороба Лайма.