Респіраторно-синцитіальні інфекції

РС-віруси належать до роду Pneumovirus. У центрі віріона розташована од- нониткова " мінус"-нитка несегментованої РНК. Вона вкрита капсидною та супер- капсидною оболонками. На поверхні вірусу розташовується Б-білок (білок злит­тя), який забезпечує проникнення вірусів у чутливі клітини. Поверхня віріонів вкрита особливими виростами (шипиками), які складаються з глюкопротеїдів. Структурні білки вірусів представлено 8 поліпептидами: N Р, Ь, М, М2, Б, О, 8Н4. Віруси не мають гемаглютинуючої та нейрамінідазної, проте проявляють частково гемолітичну та гемадсорбуючу активність. Виділяють два підтипи респіраторно- синцитіальних вірусів, які диференціюються за допомогою серологічних реакцій.

Віруси культивують у культурах клітин, одержаних із тканин мавп, великої рогатої худоби, людини, перещеплюваних клітинах Уего, НЕр-2 та ін.

РС-віруси мають досить високу чутливість до дії факторів зовнішнього сере­довища, таких як температура, ультрафіолетове опромінення, різноманітні жиро- розчинники, детергенти, дезінфектанти тощо. Тривалий час може зберігатись при температурі -70 °С.

Вірусологічна діагностика. Досліджуваним матеріалом для виділення вірусів є виділення з носоглотки, слиз з ділянки голосової щілини, мазки із порожнини носа, ротоглотки, біоптати, секційний матеріал (шматочки трахеї, бронхів) та ін. Враховуючи, що вірус надзвичайно чутливий до дії факторів довкілля, бажано проводити зараження культур клітин біля ліжка хворого або матеріал перед транс­портуванням у вірусологічну лабораторію заморожується до -70 °С.

Використовуються 3-4-денні перещеплювані лінії культур НеЬа, НЕр-2, КВ, Уего та ін. Через 3-7 днів визначають наявність вірусів у клітинах і проводять їх ідентифікацію. Візуально під мікроскопом можна виявити багатоядерні клітини (синцитій) з цитоплазматичними включеннями. За декілька днів спостерігають їх деструкцію та відшарування від скла. Ідентифікують віруси за допомогою РН, РЗК, методу імунофлуоресценції, ІФА.Серологічна діагностика. З цією метою досліджують парні сироватки хво­рого на наявність антитіл. Діагноз підтверджує чотирикратне зростання титру антитіл у другій сироватці порівняно з першою. РН і РЗК, РНГА, ІФА найчастіше використовують для ретроспективної діагностики. РЗК ставлять на холоді. Запро­поновано також нові варіанти РН - у присутності комплементу, мікрометод, реак­ція пригнічення бляшкоутворення під агаровим покриттям. Діагностикум для цих реакцій готують, заражаючи респіраторно-синцитіальним вірусом стандартні куль­тури клітин. У пробірки вносять, як правило, по 100 ЦПД₅₀.

Експрес-діагностика. Віруси (специфічний антиген) можна знайти в епітелі­альних клітинах носових ходів, ротоглотки тощо. Після обробки його імунофлуо- ресцентною сироваткою спостерігають характерне світіння поліморфних вклю­чень у цитоплазмі або всієї цитоплазми клітини. Може бути використаний непря­мий метод ензиммічених антитіл, РІА, РЗНГА, а також генетичні методи діагностики.

Ентеровірусні інфекції

Ентеровіруси людини входять до родини Picornaviridae, яка нараховує понад 70 представників: 3 серотипи поліовірусу, 29 серотипів вірусів Коксакі, 32 серо- типи вірусів ЕСНО і 4 ентеровіруси 68-71-го серотипів. Сюди віднесено також і вірус гепатиту А, який часто називають ентеровірусом 72-го серотипу.

Для лабораторної діагностики ентеровірусних інфекцій використовують віру­сологічні, серологічні та експрес-методи. Останнім часом різко знизилась захво­рюваність на поліомієліт і зросла кількість поліомієлітоподібних захворювань, які викликають віруси Коксакі, ЕСНО. Отже, вірусологічні дослідження необхід­но проводити одночасно на виявлення всіх ентеровірусів.

Матеріалом для дослідження служать випорожнення хворих протягом пер­шого тижня, змиви з носоглотки не пізніше третього дня, кров, ліквор, сеча не пізніше п'ятого дня, сироватка крові в перший і 14 дні; в разі смерті - шматочки мозку, внутрішніх органів, лімфовузли.

Випорожнення беруть у пеніцилінові флакони, емульгують у розчині Хенкса, центрифугують і додають ефір та антибіотики. Змиви з носоглотки отримують шляхом двократного полоскання горла стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію, освітлюють центрифугуванням і обробляють ефіром та антибіотиками. Середню порцію сечі (10 мл) також обробляють пеніциліном і стрептоміцином.

Кров та ліквор використовують для вірусологічних досліджень без поперед­ньої обробки. Секційний матеріал емульгують у стерильних ступках з піском, го­тують 20 % суспензію в розчині Хенкса, центрифугують і додають антибіотики

Вірусологічні дослідження. Виділення та ідентифікація ентеровірусів є ос­новним методом лабораторної діагностики. Для цього використовують різноманітні культури клітин та лабораторних тварин. Оброблений, як вище зазначено, клінічний матеріал інокулюють у 2-3 види перещеплюваних і первинних культур клітин. Наприклад, для виділення всіх 3-ох типів вірусу поліомієліту використовують пер­винні культури клітин нирок мавп і перещеплювані клітини НеЬа, Уего, НЕр-2. Віруси Коксакі В, ЕСНО успішно виділяють на клітинах ниркового епітелію мавп та на багатьох клітинах людського походження (КН, НеЬа, НЕр-2 та інші). Виді­лення вірусів Коксаки А здійснюється на культурі клітин КО.

При розмноженні ентеровірусів у культурі клітин мікроскопічно виявляють цитопатичну дію. Інфіковані клітини зморщуються, стають маленькими, кругли­ми, в їх ядрах виникає пікноз. Пізніше клітини повністю руйнуються і відпадають від стінки флакона. Такі зміни викликає вірус поліомієліту, більшість серотипів вірусів Коксакі В, ЕСНО, деякі серотипи вірусів Коксакі А. В клітинах амніону людини, епітелію нирок, диплоїдних клітинах W1-38 та КО добре репродукують­ся віруси Коксакі А та окремі серотипи вірусів ЕСНО.

Віруси Коксакі А і В успішно виділяють із досліджуваного матеріалу шля­хом зараження одноденних мишей-сисунців у мозок (0,01 мл), під шкіру (0,03 мл) або в черевну порожнину (0,05 мл). За інфікованими мишами ведуть спостере­ження протягом 14 днів. При наявності в матеріалі вірусів Коксакі А на 2-5 день у тварин появляються збудження, тремор, парези і паралічі м'язів спини і кінцівок. При Коксакі В-інфекції на 4-9 день у новонароджених мишей виникають спас­тичні паралічі. З тканин і органів тварин, що загинули, готують вірусвмістку сус­пензію для подальших досліджень. При гістологічному дослідженні виявляють дегенератині зміни в ЦНС, печінці, підшлунковій залозі та міокарді.

Індикацію ентеровірусів проводять також за цитопатичною дією в культурі клітин або за бляшкоутворенням під агаровим чи бентонітовим покриттям, а та­кож за розвитком паралічу і загибеллю тварин.

Для їх ідентифікації використовують імуноферментний аналіз, реакцію галь­мування гемаглютинації, імунофлуоресценції та РЗК. Реакцію нейтралізації на моделі клітин проводять як вище описано.

Необхідно враховувати, що при масовій імунізації дітей живою поліомієліт- ною вакциною можливе виділення вакцинних штамів. Отже, необхідно встанов­лювати походження виділених вірусів.

Виявлення ентеровірусів і визначення видів та серотипів найефективніше і найшвидше можна провести за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

Серологічні дослідження. Методом парних сироваток ставлять кольорову пробу, реакцію нейтралізації з пригніченням цитопатичної дії, бляшкоутворення, РЗК, РНГА з еритроцитарними діагностикумами. Кольорову реакцію раніше час­то ставили при серологічній діагностиці поліомієліту. Вона базується на здатності вірусу пригнічувати обмінні процеси в інфікованих культурах клітин в результаті чого зберігається вихідний колір середовища (малиновий).

Антитіла сироватки крові хворих нейтралізують вірус і метаболізм клітин продовжується. Це призводить до нагромадження кислих продуктів у системі, які змінюють РН середовища і воно набуває жовтого кольору. Наводимо схему поста­новки кольорової реакції при серологічній діагностиці поліомієліту (табл. 73).

Результати реакції враховують візуально на 5-7 добу шляхом порівняння ко­льору середовища в дослідних і контрольних пробірках. Титром сироватки вва-

Таблиця 73 Компоненти	Пробірки
	1	2	3	4	5	6	7
Живильне середовище, мл	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5
Сироватка хворого 1:5, мл:
І (1-ий ряд)	0, 5					-	0, 5
ІІ (2-ий ряд)	0, 5					-	0, 5
Розведення сироваток	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	-	-
Поліовірус певного типу, 100 ЦПД50/мл	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	-
Інкубування 30 хв при 18-20 °С
Завись клітин НеЬа з індикатором, 40000 кл/мл	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5
Інкубування 5-7 діб при 37 °С
Результати:
перша сироватка
друга сироватка

жають її найбільше розведення, при якому відбулась нейтралізація вірусу (остан­ня пробірка з культурою клітин, де середовище жовтого кольору). Діагностичне значення має наростання титру антитіл у другій сироватці не менше, ніж у 4 рази в порівнянні з першою сироваткою.

Експрес-методи лабораторної діагностики ентеровірусних інфекцій не знай­шли широкого застосування із-за особливостей їх патогенезу. Можливе викорис­тання реакції непрямої гемаглютинації з еритроцитарним поліовірусним діагнос- тикумом та непрямої реакції імунофлуоресценції. Для постановки останньої використовують імунну діагностичну антивидову сироватку, виснажену гомоло­гічними клітинами крові, амніону, фібробластами. Така сироватка реагує лише з вірусним антигеном, що знаходиться всередині клітин досліджуваного матеріалу.

Останнім часом для експрес-діагностики використовують каріологічний аналіз, оснований на виявленні характерних змін в структурі ядер клітин клінічного матеріалу, взятого у перші дні захворювання. Мікроскопують мазки з осаду після центрифугування змивів з носоглотки і сечі та мазки-відбитки з органів, які взяті при автопсії. Їх фіксують у холодному ацетоні, забарвлюють гематоксиліном. Спе­цифічним для ентеровірусних інфекцій є виявлення в препаратах зміщення хро­матину до периферії ядра і утворення яскраво-фіолетових тілець, що нагадують півмісяць. Це дає змогу дати попередню відповідь про репродукцію ентеровірусів у досліджуваному матеріалі.

Диференціацію даних та атенуйованих поліовірусних штамів здійснюють за допомогою ПЛР, ІФА, РН з моноклональними антитілами. Для поліовірусів І типу використовується бентонітовий тест (вірулентні поліовіруси мають характерис­тики А_б -, а авірулентні - А_б +).

Схема титрування антитіл за допомогою кольорової проби

бент ' ^^ бент '