Туберкульоз

Туберкульоз - первинно-хронічна інфекційна хвороба людей і тварин, яку викликають патогенні мікобактерії. Залежно від локалізації уражень виділяють туберкульоз легень, шкіри, лімфатичних вузлів, мозкових оболонок, кісток і сугло­бів, органів сечостатевої системи і черевної порожнини. Для сучасного періоду характерне збільшення захворюваності, тяжкий перебіг, підвищення смертності і поява значної кількості штамів, резистентних до багатьох протитуберкульозних препаратів.

В Україні туберкульоз у людини найчастіше викликають Mycobacterium tuberculosis і M. bovis. Дуже рідко це захворювання спричиняєM. avium. В країнах Африки, Америки та інших континентів подібні до туберкульозу захворювання викликають M. africanum, M. asiaticum, M. kansasii, M. fortuitum, M. ulcerans та ін. Ці хвороби називають мікобактеріозами. Ще один представник із роду мікобак­терій -M. leprae - є збудником прокази. Всього нараховують понад 40 видів міко­бактерій, 24 з них є патогенними і потенційно патогенними.

Лабораторна діагностика туберкульозу і мікобактеріозів включає проведен­ня мікроскопічних, бактеріологічних, біологічних, серологічних досліджень і по­становки алергічних проб. Основним методом є виділення чистої культури збуд­ника, його ідентифікації та визначення чутливості до протимікробних препаратів.

Взяття матеріалу для дослідження. Патологічним матеріалом служать харкотиння, слиз із задньої стінки глотки, плевральний ексудат, гній, спинномоз­кова рідина, промивні води бронхів і шлунка, сеча, випорожнення, пунктати, рідше кров та ін. Хворий збирає харкотиння в баночку або кишенькову плювальницю. Кращі результати отримують при дослідженні харкотиння, зібраного протягом 12­24 год. Інші матеріали збирають у стерильні банки або пробірки. На них наклею­ють етикетку з прізвищем та ініціалами хворого, групу диспансерного обліку, мету дослідження і направляють до лабораторії. Зібраний клінічний матеріал вважа­ють потенційно патогенним.

Бактеріоскопічний метод. Безпосередньо з харкотиння або осаду, який отри­мують після центрифугування гомогенізованого матеріалу, виготовляють мазки. Харкотиння переносять у чашку Петрі, розташовану на темному фоні. За допомо­гою пінцета вибирають слизово-гнійні жмуточки, переносять їх на середину пред­метного скла, накривають другим предметним склом і розтирають матеріал між скельцями. Так само готують мазки з гною та пунктатів. Спинномозкову рідину відстоюють протягом 18-20 год у холодильнику і утворену ніжну сіточку фібрину обережно розправляють на предметному склі. Сечу центрифугують і мазки виго­товляють з осаду. Саме ці мазки знебарвлюють не лише кислотою, а й спиртом для диференціації туберкульозних бактерій від M. smegmatis, яка може знаходи­тися у сечі здорових людей.

Висушені мазки фіксують сухим жаром, забарвлюють за методом Ціля-Нільсе- на або аурамін-родаміном чи іншим флуорохромом. У препаратах, зафарбованих за Цілем-Нільсеном, збудник туберкульозу має вигляд тонких суцільних паличок рубіново-червоного кольору, що розташовані поодинці або групками переважно поза клітинами (див. вкл., рис. 2).

Аурамін-родаміном мазки фарбують протягом 15 хв із підігріванням, потім промивають водою, на 30 с занурюють у солянокислий спирт і знову ретельно промивають водою. Якщо при мікроскопії фон мазка має сильну флуоресценцію, потрібно дещо погасити її 0,25 % водним розчином метиленового синього, промити водою, висушити і досліджувати під люмінесцентним мікроскопом. Туберкульоз­ні палички світяться золотавим світлом на темно-зеленому фоні. Як флуорохроми використовують також аурамін, акридиновий оранжевий та ін. Для виявлення Ь-форм мікобактерій застосовують переважно фазово-контрастну мікроскопію.

Позитивну відповідь дають при виявленні туберкульозних паличок у мазку після перегляду не менше 100 полів зору, обов'язково вказуючи кількість бактерій у кожному полі зору. Негативний результат мікроскопії не дає права виключити діагноз туберкульозу.

Суттєвим недоліком бактеріоскопічного методу є невисока чутливість: міко­бактерії можна виявити в мазку лише при наявності 50-100 тис. мікробних тіл в 1 мл патологічного матеріалу. Окрім того, за цим методом неможливо відрізнити збудника туберкульозу від інших мікобактерій та визначити його чутливість до хіміопрепаратів. Для підвищення частоти знаходження мікобактерій туберкульо­зу в досліджуваному матеріалі (особливо в харкотинні) застосовують методи зба­гачення - гомогенізації та флотації.

Метод гомогенізації. Добову порцію харкотиння вносять у флакон, добавля­ють рівний об'єм 1 % розчину КаОИ, щільно закривають гумовою пробкою і стру­шують у шюттель-апараті 10-15 хв до повного розрідження. Гомогенізовану ріди­ну центрифугують, декантат зливають у розчин хлораміну, осад нейтралізують 2-3 краплями 10 % розчину соляної або 30 % оцтової кислоти. З осаду готують мазки, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують.

Метод флотації. Порцію харкотиння (10-15 мл) гомогенізують, як вище опи­сано. Колбочку або флакон із розрідженим матеріалом ставлять на водяну баню при 55 °С на 30 хв, потім добавляють 0,5-1 мл ксилолу (бензолу, бензину, толуолу), струшують 10 хв і відстоюють півгодини. Ксилол разом з адсорбованими мікобак­теріями спливає на поверхню і утворює вершкоподібний шар. Доливають дисти­льовану воду, щоб цей шар піднявся у горлечко колбочки чи флакона. Стерильною пастерівською піпеткою частину ксилолового шару переносять на предметне скло, яке нагрівають на скляній пластинці, що лежить на водяній бані при температурі 60 °С. Висушений мазок покривають новою порцією з вершкоподібного матеріа­лу, знову висушують і так повторюють до тих пір, поки весь флотаційний шар перенесуть на мазок. Препарат промивають ефіром, висушують, фіксують сухим жаром, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують. Методи гомогенізації та флотації на 10 % підвищують знаходження мікобактерій туберкульозу в дослі­джуваному матеріалі. При цьому їх вдається виявити, якщо в 1 мл харкотиння знаходиться більше тисячі мікробних тіл.

Промивні води бронхів і шлунка також можна досліджувати за допомогою гомогенізації або флотації.

Бактеріологічний метод діагностики значно ефективніший, ніж бактеріо- скопічний. Він дає змогу виявити в 1 мл досліджуваного матеріалу 20-100 і більше мікобактерій. Його використовують не лише для постановки діагнозу хвороби, а й для контролю ефективності хіміотерапії, визначення вірулентності і стійкості міко­бактерій до антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів, виявлення змінених варіантів, особливо L-форм.

Майже всі досліджувані матеріали від хворих на туберкульоз (окрім крові, спинномозкової рідини) містять супутню мікрофлору. Тому виділити чисту куль­туру мікобактерій без попередньої їх обробки неможливо. Для знищення сторонніх мікроорганізмів харкотиння, гній, промивні води та інші матеріали обробляють 20 хв при кімнатній температурі подвійним об'ємом 6 % розчину сірчаної кисло­ти або 10 % розчином тринатрійфосфату при 37 °С протягом 18-20 год. Потім оброблений матеріал центрифугують, рідку частину зливають, а осад нейтралізу­ють, добавляючи 1-2 краплі 3 % розчину NaOH, або трикратно відмивають від кислоти ізотонічним розчином хлориду натрію.

Після нейтралізації матеріал засівають у 3-6 пробірок із щільним середови­щем Левенштейна-Йенсена (картопляний крохмаль з гліцерином, солями, яєчною суспензією і малахітовим зеленим) та Фінна-2, яке має такий же склад, як і попе­реднє, але в ньому аспарагін замінено на глютамінат натрію. Ці середовища реко­мендовані ВООЗ як стандартні в усіх країнах світу для первинного вирощування мікобактерій туберкульозу та визначення їх стійкості до хіміопрепаратів. Для інших потреб можна також використовувати гліцериновий бульйон, середовище Петра- ньяні, Павловського, Сотона.

Спинномозкову рідину, ексудат, кров, пунктат вносять піпеткою на живильне середовище без попередньої їх обробки. Всі ватні пробки зрізають на рівні вінця пробірки, проштовхують всередину на 1-1,5 см і заливають розтопленим пара­фіном для попередження висихання середовища.

Засіяні пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 3-4 тижнів. Ті пробірки з середовищами, на які матеріали сіяли петлею і втирали в поверхню агару, розміщують вертикально. Якщо посіви робили пастерівською піпеткою, пробірки вміщують у термостаті в похилому положенні на 2-3 доби, потім верти­кально. Посіви проглядають кожні 5-7 днів. Всі пробірки з раннім ростом сторон­ньої мікрофлори вилучають. У випадках раннього росту характерних колоній (до 5-го дня) роблять висновок про наявність швидкоростущих мікобактерій, тобто негативну відповідь щодо туберкульозу.

Ріст туберкульозних бактерій частіше всього появляється через 3 тижні, але бувають випадки й через 2-3 місяці. На щільних середовищах виростають грубі, шорсткі, сухі, безпігментні колонії, що мають зморщену поверхню, потовщений центр і тонкі, нерівні краї. За зовнішнім виглядом вони нагадують дольки цвітної капусти або бородавки.

Це типові R-форми колоній, властиві патогенним штамам. S-форма колоній жовтого або оранжевого кольору, як правило, характерна для інших видів міко­бактерій. Але під впливом антибактеріальних препаратів M. tuberculosis також може утворювати м'які, вологі, пігментовані 8-форми колоній. Необхідно відмічати швидкість і рясність росту.

Значно рідше досліджуваний матеріал сіють на гліцериновий бульйон, рідкі середовища з плазмою крові, бичачою сироваткою або синтетичне середовище Сотона. На них мікобактерії туберкульозу ростуть дещо швидше, мають вигляд ніжної плівки, яка з часом потовщується, грубішає, стає крихкою і випадає в осад. Із рідких середовищ роблять висів у пробірки із щільним середовищем, що збільшує число позитивних результатів, але дослідження триває довше.

Щоб підвищити частоту висівання збудника туберкульозу, досліджуваний матеріал обробляють детергентами, які мають бактерицидну дію на іншу мікро­флору (лауросепт, лаурисульфат натрію, родолан, теапол, цетавлон тощо). При цьому покращується гомогенізація матеріалу, виключається центрифугування, швидше виростають колонії.

Прискорені методи культивування. Щоб значно швидше отримати ріст міко­бактерій туберкульозу, запропоновані методи мікрокультур Прайса і Школьнікової. Метод Прайса полягає в тому, що харкотиння, гній, осад сечі, промивні води та інший матеріал наносять товстим шаром на декілька вузьких предметних скелець (звичайні скельця розрізають навпіл по довжині). Висушені мазки беруть стериль­ним пінцетом і занурюють на 15-20 хв у пробірки з 2 % розчином сірчаної кисло­ти, а потім тричі промивають стерильним розчином хлориду натрію для видален­ня кислоти. Після цього препарат вміщують у пробірки або флакони з рідким сере­довищем Сотона або цитратною кров'ю. Мазок повинен повністю покриватись живильним середовищем. Для пригнічення сторонньої мікрофлори, яка може інколи залишатись після обробки мазків кислотою, в середовище добавляють 10 ОД/мл пеніциліну. Посіви вирощують у термостаті при 37-38 °С. Через 3-4 доби скельця з мазками виймають, фіксують сухим жаром, забарвлюють за Цілем- Нільсеном або родаміном і мікроскопують. Вірулентні мікрокультури в препара­тах утворюють джгути або "коси", що формуються під впливом корд-фактора. Максимальний ріст мікрокультур відмічається на 7-10 день (див. вкл., рис. 21).

Глибинне культивування мікобактерій у гемолізованій крові за методом Школь­нікової отримують шляхом посіву матеріалу, обробленого, як звичайно, сірчаною кислотою і промитого 0,85 % розчином хлориду натрію. Через 6-8 днів вирощу­вання культуру центрифугують, з осаду виготовляють мазки, забарвлюють за мето­дом Ціля-Нільсена або флуорохромом і мікроскопують. У препаратах виявляють типові мікрокультури з характерним розташуванням у вигляді кіс і джгутів.

Щоб виявити Ь-форми мікобактерій туберкульозу, посів матеріалу після відпо­відної обробки кислотою проводять у спеціальне напіврідке середовище, розлите в пробірки у вигляді стовпчика. Вирощують при 37 °С протягом 1-2 міс. Ріст Ь-форм нагадує хмаринку з дуже дрібними включеннями, що подібні до манної крупи. Виготовлені мазки досліджують під фазово-контрастним мікроскопом, за допо­могою якого найкраще виявляють різноманітні за морфологією Ь-форми. Їх мож­на виявити і шляхом послідовних пасажів на гвінейських свинках або за допомо­гою імунофлуоресцентного методу з використанням сироваток, що містять мічені антитіла проти антигенів Ь-форм.

Для ідентифікації виділених культур збудників туберкульозу і диференціації їх від інших видів мікобактерій використовують багато ознак. Основними з них є вірулентність, швидкість росту, форма колоній, утворення пігменту, каталази, уре­ази, нікотинамідази, нітратредуктази (табл. 58).

Таблиця 58

Властивості мікобактерій, що використовуються для їх ідентифікації

Вид	Час росту, дні	Каталаза, 68 °С	Уреаза	Нікотин- амідаза	Ніаци- наза	Нітратре- дуктаза	Піг­мент
M. tuberculosis	12-25	-	±	+	+	+	-
M. bovis	24-40	-	+	-	-	-	-
M. africanum	31-42	-	+	+	-	-	-
M. kansasii	10-20	+	+	+	-	+	+
M. avium	10-12	+	-	+	-	+	-
M. smegmatis	3-5	±	+	+	-	+	-

Найважливіша ознака M. tuberculosis - ніациновий тест - здатність синтезу­вати значну кількість нікотинової кислоти (ніацину). Каталазна активність відносно слабка і втрачається при 68 °С. Для швидкої диференціації збудників туберкульозу людини рекомендують посів на середовище Левенштейна-Йенсена з 500 мкг/мл і 1000 мкг/мл саліцилового натрію. Мікобактерії туберкульозу за таких умов на цьому середовищі не ростуть.

Питання про вірулентність мікобактерій вирішується на основі біологічних проб і виявленні корд-фактора. Останній визначають методом мікрокультур Прайса, а також на основі міцного зв'язування таких барвників, як нейтральний червоний або нільський голубий. При нанесені на мазок розчину NaOH туберкульозні палич­ки зберігають колір барвника, в той час як невірулентні мікобактерії змінюють відповідне забарвлення.

Для надійної ідентифікації видів мікобактерій у сучасних умовах розроблені прогресивні, швидкі й дуже точні методи визначення у таких досліджуваних ма­теріалах, як харкотиння, плевральна рідина, ліквор, гній, сироватка крові, вміст шлунка, тканини тощо. Ці об'єкти, знезаражені нагріванням, зберігаються необ­межений час і в будь-який момент можуть бути досліджені. Серед них найбільшої уваги заслуговує молекулярно-генетичний метод полімеразної ланцюгової реакції. Він грунтується на виявленні в біологічному матеріалі ДНК мікобактерій. Навіть якщо в матеріалі знаходиться всього 5-10 мікробних клітин, за допомогою оліго- нуклеотидів-праймерів запускають синтез специфічних фрагментів ДНК у цик- лотермостаті, які потім можна ідентифікувати методом гельелектрофорезу. Резуль­тати досліджень отримують через 3-4 години.

Специфічні антигени в тих же матеріалах можна також швидко виявити і за допомогою імуноферментного аналізу, якщо мати відповідні антитіла, адсорбо­вані на твердій фазі у полістиролових планшетах.

Визначення стійкості мікобактерій до хіміопрепаратів. Лікарську стійкість збудників туберкульозу визначають способом серійних розведень перед початком лікування, через 3 місяці і надалі при продовженні виділення туберку­льозних паличок через кожні 6 місяців. Це роблять шляхом вирощування культур на середовищах із різною концентрацією туберкулостатиків.

Є два способи визначення резистентності мікобактерій: прямий і непрямий. При прямому способі безпосередньо сіють відповідно оброблений матеріал на середовища з різними концентраціями антибіотиків чи інших хіміопрепаратів. Він ефективніший, але ним можна користуватися лише тоді, коли в матеріалі виявля­ють не менше 5 мікобактерій в кожному полі зору. При непрямому способі на середовище з протитуберкульозними препаратами сіють попередньо виділені куль­тури мікобактерій. В обох випадках обов'язковий контроль - посів на таке саме середовище без туберкулостатиків.

У сучасних умовах найбільш поширені такі методи визначення лікарської стійкості мікобактерій:

1. культивування на щільному середовищі Левенштейна-Йенсена;

2. мікрокультивування на скельцях за Прайсом;

3. глибинні посіви в напівсинтетичні середовища.

У пробірки, які містять різну концентрацію препаратів, і в одну контрольну (без туберкулостатика) засівають завись виділеної культури (500 млн мікробних тіл в 1 мл). Культуру вважають чутливою, якщо в пробірці з препаратом виросло менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Якщо виросло більше 20 колоній, культуру вважають стійкою. Резистентність даного штаму виражають тією макси­мальною концентрацією антибактерійного препарату, при якій ще відбувається ріст, наближений до росту в контролі (табл. 59)

Таблиця 59

Шкала оцінки резистентності мікобактерій до лікарських засобів

Препарат	Стійкі при рості на середовищах, що містять препарат, мгк/мл
	щільних	рідких
Стрептоміцин	5	5
Тубазид	1	1
ПАСК	5	10
Циклосерин	50	50
Канаміцин	25	10
Етіонамід	30	5
Біоміцин	30	10

Біологічний метод діагностики туберкульозу - зараження гвінейських сви­нок - є найчутливішим. Інфікуюча доза збудника для цих тварин складає всього декілька бактерійних клітин. Досліджуваний матеріал обробляють 2 % розчином сірчаної кислоти протягом 20 хв, включаючи центрифугування. Потім осад тричі відмивають 0,85 % розчином хлориду натрію і емульгують його в 1-2 мл ізотоніч­ного розчину. Емульгований осад вводять підшкірно в пахвинній ділянці двом гвінейським свинкам масою 250-300 г з негативною пробою Манту. При малій кількості матеріалу його вводять у черевну порожнину або паранхіму яєчка. Та­кий спосіб зараження підвищує чутливість біопроби, особливо в тих випадках, коли в матеріалі містяться маловірулентні палички туберкульозу, стійкі до ізоніа­зиду та інших хіміопрепаратів.

Через 2-3 тижні заражених тварин зважують, визначають розміри збільше­них лімфатичних вузлів і ставлять пробу Манту, яку повторюють через 6 тижнів. Місцеві патологічні зміни, зменшення маси тіла дають підставу для розтину гвінейських свинок і дослідження їх внутрішніх органів. При негативних резуль­татах тварин умертвляють через 3-4 міс, гістологічно досліджують паренхіматозні органи і роблять посіви на елективні середовища.

Гвінейських свинок використовують і для виявлення L-форм мікобактерій туберкульозу. В таких випадках потрібно зробити декілька послідовних заражень, оскільки L-форми мають меншу вірулентність і викликають у тварин доброякіс­ний перебіг туберкульозу, який при реверсії L-форм може перейти в генералізова- ний процес.

Останнім часом все ширше використовують біопробу на білих мишах, зара­жаючи їх інтрацеребрально. Постановка біологічних проб на лабораторних тва­ринах - це своєрідний "золотий стандарт" при діагностиці туберкульозу.

Серологічна діагностика. Для виявлення протитуберкульозних антитіл спо­чатку були запропоновані реакції аглютинації, преципітації та зв'язування комп­лементу. Тепер їх використовують рідко. Натомість стали широко практикувати реакцію непрямої гемаглютинації. Як антиген у ній використовують сенсибілізо­вані еритроцити барана або людини О-групи. Їх навантажують екстрактом із ту­беркульозних бактерій або очищеним туберкуліном. До 1 мл осаду еритроцитів додають 20 мл екстракту мікобактерій, витримують при 37 °С протягом 2-ох год і відмивають центрифугуванням для видалення надлишку антигену. Перед поста­новкою РНГА сироватку хворого виснажують еритроцитарною масою для усу­нення неспецифічного реагування. Потім сироватку розводять від 1:2 до 1:272. Діагностичним титром вважають розведення 1:8. При туберкульозі РНГА буває позитивною у 70-90 % випадків.

Хороші результати дає також імуноферментний аналіз, імуноблотинг і реакція агрегат-гемаглютинації для визначення циркулюючих імунних комплексів. Ще точ­нішим є радіоімунний метод, але через високу вартість діагностикумів і відсутність радіометричної апаратури він рідко використовується в лікувальних закладах.

Для вдосконалення серологічної діагностики туберкульозу важливо налаго­дити випуск моноклональних антитіл до різних антигенів мікобактерій. З їх допо­могою можна було б виявляти специфічні епітопи бактерій, а також відповідні їм антитіла. Виявлення таких антитіл буде мати важливе діагностичне значення.

Алергічний метод. Туберкулінова внутрішньошкірна проба Манту є специ­фічним діагностичним тестом. Його використовують для визначення інфікованості населення туберкульозом, масового обстеження на туберкульоз дітей і підлітків, відбору осіб, яким потрібно проводити ревакцинацію, перевіряти її ефективність, а також із метою діагностики туберкульозу та визначення активності процесу. Для постановки проби використовують туберкулін. У 1890 р. Роберт Кох запропону­вав перший препарат, так званий старий туберкулін Коха (Alttuberkulin Koch або

АТК). Його виготовляють із суміші культур мікобактерій людського й бичачого типів, вирощених у гліцериновому бульйоні протягом 5-6 тижнів. Культуру стери­лізують текучою парою 30 хв, випарюють при 70 °С до 1/10 первинного об'єму, фільтрують через бактерійний фільтр і розливають в ампули. Туберкулін Коха містить ряд баластних речовин і важко піддається стандартизації. Починаючи з 1934 р., для постановки алергічних проб Зейберт запропонував високоочищений препарат туберкуліну, який назвали РРБ-S (Purified protein derivative - Seibert). Через 5 років М.А. Ліннікова виготовила очищений туберкулін під назвою ППД-Л. Його дозують у туберкулінових одиницях (ТО). 1 ТО вміщує 0,00006 мг сухого препарату. Випускають ППД-Л у двох формах: сухий очищений туберкулін по 50000 ТО в ампулі і ППД-Л у стандартному розведенні в ампулах по 3 мл. У 0,1 мл розчину міститься одна доза (2 ТО).

Препарат вводять внутрішньошкірно однограмовим туберкуліновим шпри­цом в об'ємі 0,1 мл у середній третині передпліччя. Перед ін'єкцією шкіру проти­рають 70 % етиловим спиртом. Тонку голку зрізом вверх вводять у поверхневий шар шкіри під кутом 15° до її поверхні.

Результати алергічної проби оцінюють через 72 год за такою схемою: нега­тивна проба - повна відсутність папули; сумнівна - папула розміром 2-4 мм або лише гіперемія будь -якого розміру; позитивна - папула діаметром 5 мм і більше; гіперергічна - у дітей і підлітків папула діаметром 17 мм і більше, у дорослих - 21 мм і більше.