Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

Антибіотики - це речовини мікробного, рослинного або тваринного похо­дження, їх напівсинтетичні та синтетичні аналоги і похідні, що вибірково при­гнічують життєдіяльність мікроорганізмів, вірусів, найпростіших, грибів, а також затримують ріст пухлин.

Антибіотикам притаманна висока біологічна активність. Вони спричиняють біологічний ефект у дуже малих кількостях (наприклад, пеніцилін викликає вира­жену бактерицидну дію на бактерії у концентрації 0,000001 г/мл). Антибіотики мають високу вибіркову специфічність, оскільки проявляють свою дію тільки відповідно до певних груп організмів, не завдаючи шкоди іншим. Так, бензилпе­ніцилін затримує ріст грампозитивних бактерій (стафілококів, стрептококів) і прак­тично не впливає на грамнегативні мікроби, гриби.

Біологічну активність антибіотиків оцінюють в умовних одиницях, які міс­тяться в 1 мл розчину (ОД/мл) або в 1 мг препарату (ОД/мг). У таких антибіотиків, як еритроміцин, новобіоцин, ністатин, трихоцетин та ін. одна одиниця активності еквівалентна 1 мкг препарату. За одиницю антибіотичної активності пеніциліну приймають мінімальну кількість препарату, здатну затримувати ріст штаму Staphylococcus aureus 209 у 50 мл поживного бульйону. Активність стрептоміцину вимірюється мінімальною кількістю антибіотика, який інгібує ріст Escherichia coli в 1 мл поживного бульйону. Фактично для більшості антибіотиків 1 ОД відповідає 1 мкг хімічно чистого препарату. Однак є антибіотики, для яких існують винятки. Так, наприклад, для пеніциліну 1 ОД відповідає 0,6 мкг, поліміксину В - 0,1 мкг, ністатину - 0,333 мкг хімічно чистих антибіотиків.

Оцінка чутливості мікробів до антибіотиків та вивчення їх фармакокінетики в організмі хворого є основними лабораторними показниками, які при їх співстав- ленні дозволяють прогнозувати ефективність антибактеріальної терапії. Крім того, результати визначення антибіотикочутливості використовують як маркер, що доз­воляє виявляти та контролювати зміни антибіотикограми збудників у динаміці, використовувати детермінанти резистентності, які найчастіше зустрічаються, або їх сполучення як додаткові маркери при діагностиці внутрішньолікарняних інфек­цій, для виявлення джерел інфікування та шляхів розповсюдження полірезистент- них штамів. Такі дані, одержані та узагальнені у різних регіонах країни протягом фіксованих проміжків часу, використовуються при формуванні політики антибак­теріальної терапії та визначенні номенклатури антибіотиків, які випускаються в країні.

Найрозповсюдженішими методами визначення антибіотикочутливості збуд - ників інфекцій є диско-дифузійний (метод дисків) та серійних розведень.

Живильні середовища для визначення чутливості бактерій до антибіотиків повинні відповідати таким вимогам:

• бути стандартними та забезпечувати оптимальні умови росту мікроорганізмів;

• не містити інгібіторів бактеріального росту і великої кількості стимуляторів;

• не мати речовин, що пригнічують активність препаратів.

На результати дослідження може суттєво впливати значення рН середовища. Найдоцільніше вибирати нейтральне або дещо лужне середовище (рН 7,0-7,4), оскільки ці значення придатні для більшості антибіотиків. При визначенні чутли­вості бактерій використовують бульйон і 1,5-2 % агар на переварі Хоттінгера, зви­чайний м'ясо-пептонний бульйон і 1,5-2 % агар на ньому, середовище АГВ (агар Гівенталя-Вєдьміної), агар Mueller-Hinton 2. Вони придатні при визначенні анти­біотикочутливості стафілококів, ентеробактерій, псевдомонад. Однак стрептоко­ки та гемофільні бактерії вимагають добавки ростових факторів; дріжджі та ана­еробні бактерії - спеціальних середовищ і певних умов культивування. На резуль­тати визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків-аміноглікозидів, поліміксинів, тетрациклінів впливає вміст у живильних середовищах катіонів каль­цію, магнію, що особливо важливо при дослідженні P. aeruginosa. Оптимальний вміст - 50 мг/л Са²+і 25 мг/л Mg²+. Більшість середовищ, що випускаються країна­ми СНД, за цим показником, як правило, не стандартизуються. Це призводить до суттєвих коливань вмісту двовалентних катіонів у різних серіях середовищ, навіть якщо вони випускаються одним підприємством, і спотворює результати.

Диско-дифузійний метод визначення антибіотикочутливості є найпростішим якісним методом і широко використовується для епідеміологічного контролю ре­зистентності. Достовірність результатів забезпечується шляхом стандартизації проведення тесту на всіх етапах дослідження: вибір і виготовлення живильних середовищ із врахуванням всіх властивостей можливих збудників, взяття проб і умови їх доставки, виготовлення і розливання посівного матеріалу на поверхню агару, вибір дисків (використання набору дисків у відповідності до виду виділе­ного збудника та локалізації інфекції).

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків слід визначати тільки у чистій культурі. Однак у ряді випадків для швидкого одержання орієнтовних даних про антибіотикограму бактерій використовують безпосередньо патологічний матері­ал. Щільні субстрати (харкотиння, гній, кал та ін.) розтирають, рідини (сеча, ексу­дати та ін.) центрифугують, а для посіву використовують осад. Досліджуваний матеріал наносять на поверхню живильного середовища петлею або ватним там­поном. Після одержання чистої культури дослідження повторюють.

Для виготовлення інокулюму 5-10 однорідних колоній суспендують у 2 мл рідкого середовища або фізіологічного розчину. Бактеріальну суспензію (10³-10⁵ КУО/мл залежно від виду мікробів) в об'ємі 1 мл рівномірно розподіляють по поверхні середовища при похитуванні чашки, надлишок рідини видаляють піпет­кою. Чашки підсушують при кімнатній температурі протягом 20-30 хв, а потім на них на однаковій віддалі кладуть диски з антибіотиками.

Рівномірність газону, яка визначається величиною посівної дози, - найголов­ніший фактор одержання достовірних результатів і підлягає кількісній оцінці та якісній стандартизації. Ступінь нестандартності результатів дослідження, який пов'язаний із зміною величини дози інокулюму, варіює залежно від виду збуд­ників, властивостей антибіотика та інших факторів. При невеликій дозі інокулю- му при визначенні чутливості до бета-лактамних препаратів пеніциліназо-утво- рюючих бактерій можна одержати великі розміри зон затримки росту, які створю­ють уявлення про високу чутливість штамів. І, навпаки, розмір зон різко знижується при збільшенні щільності інокулюму. Вирішальне значення має його величина при визначенні чутливості до бета-лактамних антибіотиків метицилінорезистент- них варіантів стафілококів внаслідок гетерогенності їх саме за показником чутли­вості. Для виявлення стійкості до метициліну необхідно дотримуватись певних температурних режимів (30-35 °С). Оскільки ці стафілококи повільніше ростуть при 37 °С, слід їх культивувати на середовищах з додаванням 5 % хлориду натрію. Результати враховують через 24 та 48 год (рис. 40). Для контролю стандартності проведення досліджень у кожному досліді використовують тест-культури з відо­

мою чутливістю до антибіотиків. ВООЗ рекомен­дує три штами типових культур: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. При визначенні антибіотикочутливості виділених штамів слід співставляти отримані дані з розмі­рами зон пригнічення росту навколо дисків з ан­тибіотиками для контрольних культур (табл. 12). Їх порівнюють з допустимими контрольними зна­ченнями.

Рис. 40. Визначення антибіотико­чутливості за допомогою методу стандартних дисків.

Якщо діаметри зон пригнічення росту конт­рольних штамів знаходяться у певних межах, це свідчить про достатню стандартизацію і точність проведених експериментів. Не слід розміщати на чашці Петрі понад 6 дисків, так як при великих діаметрах зон затримки росту це може бути джерелом помилок і впливати на кількісну інтерпретацію результатів. Правильний підбір набору дисків є факто­ром, який визначає коректність досліджень і, без сумніву, інтерпретацію резуль-

Таблиця 12 Граничні межі діаметрів зон затримки росту еталонних штамів	Діаметри зон затримки росту, мм
	на середовищах № 1 і № 2			на середовищі АГВ
Антибіотики	S. aureus	E. coli	P. aeruginosa	S. aureus	E. coli	P. aeruginosa
	ATCC	ATCC	ATCC	ATCC	ATCC	ATCC
	25923	25922	27853	25923	25922	27853
1	2	3	4	5	6	7
Бензилпеніцилін	-	-	-	29-38	-	-
Ампіцилін	24-35	13-20	-	30-36	14-20	-
Карбеніцилін (25 мкг)	-	-	-	32-38	19-25	-
Карбеніцилін (100 мкг)	-	21-26	20-24	35-42	23-29	18-24
Метицилін	-	-	-	22-30	-	-
Оксацилін	27-32	-	-	24-30	-	-
Цефалотин	24-37	15-22	-	30-40	15-20	-
Стрептоміцин	17-25	14-22	-	20-25	14-19	-
Неоміцин	19-27	18-24	-	20-27	13-17	-
Канаміцин	20-27	18-26	-	20-27	15-19	-
Гентаміцин	20-28	20-27	16-24	22-32	21-30	16-26
Тетрациклін	20-29	19-26	-	22-31	17-26	-
Еритроміцин	23-31	-	-	22-31	8-15	-
Олеандоміцин	20-29	-	-	22-29	-	-
Лінкоміцин	24-32	-	-	24-32	-	-
Левоміцетин	21-27	26-28	-	19-25	19-27	-
Рифампіцин	-	-	-	26-34	7-11	-
Поліміксин	-	12-17	-	-	16-20	15-20
Ристоміцин	14-18	-	-	12-16	-	-

татів. Орієнтовні дані щодо вибору наборів дисків із врахуванням виду виділено­го збудника і локалізації інфекції наведено у таблиці 13.

Таблиця 13