- •УЧастина і загальна мікробіологія
- •Організація, устаткування, режим роботи бактеріологічних, імунологічних і вірусологічних лабораторій
- •Методи лабораторних досліджень
- •1. Феноловий генціанвіолет
- •Культивування мікроорганізмів
- •Екологія мікроорганізмів
- •Мікробіологічне дослідження води
- •Визначення індексу бгкп на етапах очищення
- •Дослідження мікрофлори повітря
- •Мікробіологічне дослідження грунту
- •Мікробіологічні дослідження харчових продуктів
- •Дослідження мікрофлори людини
- •Експериментальна інфекція. Використання тварин в лабораторних дослідженнях
- •Способи зараження експериментальних тварин
- •Мікробіологічне дослідження трупа
- •Визначення чутливості бактерій до антибіотиків
- •Основні набори дисків, які рекомендуються для визначення чутливості залежно від виду виділеної культури та патологічного матеріалу
- •Частина іі імунологія
- •Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань
- •Імунопрофілактика та імунотерапія інфекційних захворювань
- •Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань Стафілококові інфекції
- •Захворювання, спричиненні умовно-патогенними ентеробактеріями
- •Ранова анаеробна газова інфекція
- •Бактероїдози
- •Дифтерія
- •Коклюш і паракоклюш
- •Псевдомонадні інфекції
- •Інфекції, викликані гемофільними бактеріями
- •Легіонельози
- •Лістеріоз
- •Туберкульоз
- •Лепра (проказа)
- •Мікобактеріози
- •Актиномікоз
- •Нокардіоз
- •1 2 Рис. 80. N.Asteroides: колонії (1), ланцюжки і конідії в мазку (2).
- •Сифіліс та інші трепонематози
- •Ендемічні побутові трепонематози
- •Лептоспіроз
- •Епідемічний поворотний тиф
- •Ендемічний поворотний тиф
- •Бореліоз Лайма
- •Рикетсіози
- •Епідемічний висипний тиф
- •Ендемічний висипний тиф
- •Північноазіатський рикетсіоз
- •Гарячка цуцугамуші
- •Пароксизмальний рикетсіоз
- •Трахома
- •Респіраторний хламідіоз
- •Сечостатевий хламідіоз
- •Будова і класифікація вірусів
- •Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій
- •Методи ідентифікації вірусів
- •Виділення та титрування бактеріофагів
- •Парагрип
- •Епідемічний паротит
- •Респіраторно-синцитіальні інфекції
- •Ентеровірусні інфекції
- •Ротавірусні гастроентерити
- •1 Ерпесвірусні інфекції
- •Простий герпес
- •Вітряна віспа - оперізуючий герпес
- •Цитомегалія
- •Аденовірусні інфекції
- •Коронавірусні інфекції
- •Гарячки Марбург і Ебола
- •Арбовірусні інфекції
- •Весняно-літній кліщовий енцефаліт
- •Японський енцефаліт
- •Гарячка Західного Нілу
- •Жовта гарячка
- •Геморагічні гарячки
- •Кримська-Конго геморагічна гарячка
- •Геморагічна гарячка з нирковим синдромом
- •Краснуха
- •Лімфоцитарний хоріоменінгіт
- •Гепатит в
- •Кандидоз
- •.Частина VI протозойні інфекції
- •Методи лабораторної діагностики
- •Малярія
Мікробіологічне дослідження трупа
Розтин і мікробіологічне дослідження загиблих тварин має велике, часом вирішальне діагностичне значення. Воно проводиться з метою виявлення і визначення локалізації збудника інфекційного захворювання. Трупний матеріал досліджують за допомогою бактеріоскопічних (вірусоскопічних) і бактеріологічних методів. Досліджуваний матеріал беруть під час розтину трупа, яке проводять, дотримуючись встановлених правил.
Розтин трупа та його мікробіологічне дослідження потрібно робити якомога скоріше після смерті. До цього його необхідно зберігати на холоді, оскільки мікрофлора кишечника при низькій температурі повільніше проникає в кров, тканини й паренхіматозні органи. Розтин трупа та забір матеріалу необхідно проводити в умовах, які виключають його забруднення сторонніми мікроорганізмами. Взятий матеріал до посіву не повинен контактувати з дезінфікуючими речовинами, а після посіву - знезаражуватись. Результати досліджень обов'язково протоколюються. Під час розтину трупа та дослідження його матеріалів необхідно абсолютно попередити всіляку можливість інфікування як самих працюючих, так і інших осіб, а також контамінації оточуючого середовища.
Тварин, що загинули від експериментальної інфекції, також досліджують з дотриманням правил асептики. При цьому використовують лише стерильні інструменти. Їх переносять із стерилізатора в склянку зі спиртом і ватою на дні, перед кожним використанням обпалюють на вогні.
Загиблу тварину захоплюють пінцетом, кладуть спиною донизу на дерев 'яну дощечку, вміщену в металеву клювету з дезрозчином. До дощечки її прикріплюють булавками або гострими гвіздочками за чотири лапки, широко розтягуючи її. Шкіру в місці розтину змочують дезінфікуючим розчином, щоб не розліталась шерсть, яка містить автохтонну мікрофлору. Трупи тварин, які загинули від чуми та інших особливо небезпечних інфекцій, перед розтином занурюють у керосин для інактивації комах - перенощиків хвороби. Перед першим розрізом шкіру ретельно протирають дезрозчином, спиртом або обпалюють полум'ям газового пальника.
Розтин і дослідження трупа тварини проводять у певній послідовності: спочатку розрізають і досліджують зовнішні покриви, потім грудну й черевну порожнини.
Розтин зовнішніх покривів починають з розрізу шкіри від нижньої щелепи до лобка, потім роблять бокові надрізи в напрямку до лапок. Шкіру відсепарову- ють і відкидають в обидва боки, відкриваючи всю передню поверхню тіла (рис .38). В підшкірній клітковині відмічають такі зміни як гіперемію судин, крововиливи, набряки, стан лімфатичних вузлів. При їх збільшенні або нагноєнні роблять посіви на живильні середовища та мазки-відбитки, притискаючи поверхню розрізу вузла до предметного скла.
Перед розтином грудної порожнини її відкриту від шкіри поверхню змочують спиртом і запалюють. Пінцетом захоплюють мечоподібний відросток, роблять поперечний надріз під ним, вставляють ножиці і проводять два бокові розрізи в місцях сполучення ребер із грудною кісткою. Утворений лоскут відкривають доверху й оглядають легені та серце, відмічають наявність ексудату. Обов 'язково роблять посів крові з серця. Для цього розжареним скальпелем припікають стінку шлуночка або передсердь і в даній ділянці роблять прокол пастерівською піпеткою з тонко відтягнутим у полум'ї пальника кінцем. Кров, що потрапила в капіляр, сіють в цукровий бульйон і на агар, а із залишку роблять мазки. При потребі проводять також посіви та роблять мазки-відбитки з легень, плеври та ексудату.
Рис.
38.
Послідовні
етапи розтину білої миші.
люють і трохи підіймають вверх, ножицями розрізають її від діафрагми до лобка і по два бокових надрізи в напрямку до лапок. Утворені лоскути відвертають в обидва боки. Оглядають внутрішні органи, відмічаючи в протоколі величину, колір і консистенцію печінки, селезінки, нирок, надниркових залоз, лімфатичних вузлів брижі та наявність ексудату.
В разі потреби роблять посіви тканин вказаних органів та ексудату. Для цього припікають поверхню органа розжареним скальпелем і в цій ділянці проводять розріз. Бактеріологічною петлею з поверхні розрізу роблять зскрібок паренхіми і сіють на живильні середовища. Для виготовлення мазків-відбитків вирізають шматочок органа й поверхнею розрізу притискають до предметного скла, або розмазують по ньому тонким шаром.
Трупи тварин і залишки органів після бактеріологічного дослідження спалюють або стерилізують. Якщо тварини загинули від особливо небезпечних інфекцій, їх розтини й посіви проводять у спеціальних режимних лабораторіях із дотриманням особливо пильних заходів безпеки.
Вирощування посівів, виділення чистих культур та визначення видів збудників проводять за загально прийнятими методами.
Визначення вірулентності мікроорганізмів, смертельної дії екзотоксинів та ендотоксинів
Майже в усіх бактеріологічних лабораторіях в дослідах на тваринах часто визначають патогенні й вірулентні властивості збудників інфекційних захворювань. Патогенність - це потенційна здатність певного виду мікроорганізмів викликати інфекційний процес. Вона не є абсолютною і стабільною. Ступінь або міру патогенності визначають вірулентністю. Для її кількісного визначення запропоновані три умовні одиниці вірулентності.
Dosis letalis minima (DLM) - мінімальна смертельна доза, тобто найменша кількість живих мікроорганізмів або найменша доза токсину, яка здатна викликати загибель 95 % тварин стандартної маси і віку через певний проміжок часу. Ця величина відносна й залежить від виду тварин. DLM для мишей, щурів, гвінейських свинок і кроликів буде різною.
Dosis certa letalis (DCL) - безумовно смертельна доза, яка викликає загибель 100 % взятих у дослід тварин; вона також є відносною.
Dosis letalis50 (DL50) - кількість мікроорганізмів (або токсину), яка викликає загибель 50 % взятих у дослід тварин. Остання величина є статистично найбільш достовірною летальною дозою. Вона визначається на основі обробки конкретних результатів загибелі тварин за методом Ріда і Менча, у якому реалізуються кумулятивні принципи обліку результатів.
Інколи визначають і мінімальну інфікуючу дозу (ІД50), тобто найменшу кількість мікробів, яка викликає захворювання у 50 % заражених тварин.
Титрування мінімальних смертельних доз, як правило, проводять на білих мишах як найбільш доступних і дешевих тваринах (рідко на гвінейських свинках
і кроликах). Мікроби (токсини) вводять внутрішньоочеревинно або внутрішньовенно. Щоб отримати стабільні результати використовують тварин стандартної маси і віку. Мишей відбирають масою 16-18 г, гвінейських свинок - 200-250 г, кроликів - 1500 г.
Завись бактерій для зараження готують із молодих агарових культур після 18-20 год їх вирощування в термостаті. Для цього в пробірку з культурою на скошеному агарі вносять 5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію й ретельно струшують. Частину густого змиву переносять в іншу пробірку такого ж діаметру як і пробірка зі стандартом мутності. Завись розводять 0,85 % розчином хлориду натрію до мутності, яка відповідає вибраному стандартові.
Централізованим шляхом готують такі еталонні стандарти мутності: № 5 - на п'ять одиниць мутності, що відповідає 500 млн мікробів у 1 мл; № 9 - 900 млн мікробів у 1 мл; № 10 - 1 млрд мікробів у 1 мл; № 11 - 1,1 млрд мікробів у 1 мл. Виготовляють також стандарти мутності для коклюшних бактерій на 9, 10 і 11 млрд мікробів у 1 мл.
При визначенні вірулентності мікроорганізмів, як правило, виготовляють вихідну завись, в якій знаходиться 1 млрд бактерій в 1 мл. Тоді для введення миші 100 млн мікробів беруть 0,1 мл зависі, для введення 200 млн - 0,2 мл і т.д. Стандартизовані зависі готують так, щоб бажані дози бактерій містились в однакових об' ємах, а загальної кількості їх повинно вистачити на всю групу тварин (наприклад, по 0,2 мл на 4-6 тварин).
Через 24-48 год після зараження відмічають кількість тварин, що загинули в кожній групі і вираховують ОЬ50 за методом Ріда і Менча.
Наприклад, із наведених в таблиці даних видно, що ОЬ50 знаходиться між розведеннями зависі мікробів 10-5 і 10-6. Для точного підрахунку ОЬ50 визначають величину х, яку додають до логарифму того розведення, яке менше 50 % дози (у наведеному прикладі 5) за формулою:
А -50
X — •
А - В
де А - % тварин, які загинули від розведення менше 50 % (у даному випадку 66,7 %); В - % тварин, що загинули від розведення більше 50 % дози (за даними таблиці - 33,3 %). Підставивши у формулу отримані числові значення, одержимо
Обчислення
БЬ,. за методом Ріда і Менча
Таблиця 11 Розведення зависі мікробів |
Кількість заражених тварин |
З них |
% тварин, що загинули |
||
загинуло |
вижило |
||||
10-4 |
6 |
6 |
0 |
100 |
|
10-5 |
6 |
4 |
2 |
66,7 |
|
10-6 |
6 |
2 |
4 |
33,3 |
|
10-' |
6 |
0 |
6 |
0 |
Отже, ОЬ50 відповідатиме розведенню зависі 10. Враховуючи, що при серійних розведеннях послідовно з пробірки в пробірку переноситься 0,1 мл матеріалу (тобто, додається до 0,9 мл ізотонічного розчину), в 1 мл вихідної зависі бактерій міститься 106,5 ВЬ50.
Розділ 7 ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ
Генетика бактерій та вірусів - наука, що вивчає механізми успадковування генетичних ознак та їх фенотипові прояви. Генетичний апарат прокаріотів побудований із двоспіральної суперспіралізованої ДНК. Сукупність генів нуклеоїду і позахромосомних факторів зумовлює генотип бактерій, а фенотип - це індивідуальний вияв генотипу в конкретних умовах існування.
Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову, або модифікаційну та спадкову, або генотипову. Неспадкова мінливість виникає під впливом факторів зовнішнього середовища (зміна морфології клітини, поява L-форм тощо). Модифікаційні зміни нетривалі, після припинення дії агента вони зникають. При генотиповій мінливості різноманітні ознаки бактерій успадковуються. Ця мінливість виникає внаслідок мутацій, трансформацій, коньюгацій і трансдукцій.
Вивчення модифікаційної мінливості бактерій. Готують 2 чашки Петрі, одна з яких містить м'ясо-пептонний агар з 0,1 % фенолу, інша - звичайний МПА. На поверхню чашок засівають культуру Proteus vulgaris. Посіви інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом доби. Потім вивчають особливості росту мікробів на поверхні агару, роблять мазки, забарвлюють їх за Грамом і розглядають під імерсійним об'єктивом. На контрольному середовищі (МПА) вульгарний протей представлено невеликими грамнегативними паличками, які мають тенденцію до повзучого росту по поверхні середовища. На агарі з фенолом спостерігається тенденція до утворення ізольованих колоній, в мазках видно ниткоподібні форми бактерій, часом із колбоподібними потовщеннями на кінцях.
Фенол як фактор модифікаційної мінливості може викликати втрату рухливості протеїв. Для її перевірки добову культуру P. vulgaris засівають у дві пробірки: одна з них містить звичайний МПБ (контроль), інша - 0,1 % феноловий МПБ. Через добу культивування при температурі 37 °С у висячій краплі перевіряють рухливість збудників.
У контрольній пробірці вони зберігають рухливість, у дослідній - мікроби нерухомі. Для доведення природи модифікаційної мінливості мікроби засівають на звичайний м'ясо-пептонний агар і після 18-24-годинного культивування перевіряють біологічні ознаки, в яких у цьому випадку спостерігається реверсія.
Метод реплік для виявлення мутантів. На чашку Петрі із повноцінним м'ясо-пептонним агаром за добу до досліду засівають 0,1 мл добової бульйонної
культури E. coli, розведеної до 10-3 ступеня із розрахунку, щоб виросло 100 колоній. На наступний день готують мінімальне живильне середовище, яке не містить ростових факторів для бактерій (глюкозо-сольовий агар), і чашку з повноцінним середовищем. Для досліду використовують штамп-реплікатор, який представляє собою дерев'яний або металевий циліндр товщиною до 1 см з діаметром дещо меншим, ніж чашка Петрі (рис. 39). Його робоча поверхня вкрита оксамитом, вор-
саланом або іншим матеріалом, що має дрібні ворсинки. Відкривають чашку Петрі, на якій виросли колонії мікроорганізмів (матрична чашка), і прикладають до неї штамп-реплікатор. Після цього переносять колонії, які прикріпились до ворсинок, на дослідну і контрольну чашки Петрі (чашки-репліки) із відповідними се- Рис. 39. Метод реплік. редовищами. Необхідно звернути увагу на
точне фіксування положення штампа-ре- плікатора на матричній чашці і чашках-репліках. Після добової інкубації при температурі 37 °С вивчають колонії, що виросли на чашках і підраховують їх кількість. Відмічають колонії мікроорганізмів, які не виросли на мінімальному живильному середовищі. Вони є ауксотрофними мутантами, тому що нездатні синтезувати відповідні ростові фактори.
Ідентичний експеримент можна поставити для виділення мутантів, які є резистентними до антибіотиків, не потрапляючи попередньо під їх вплив (селекційна дія).
Флуктуаційний тест Лурія і Дельбрюка для виявлення частоти спонтанних мутацій. Для того, щоб виявити частоту спонтанних мутацій, які зумовлюють стійкість до стрептоміцину (Str варіанти), відбирають чутливий до цього антибіотика штам E.coli. З добової культури бактерій у стерильному ізотонічному розчині хлориду натрію готують суспензію клітин з концентрацією 1000-10000 клітин в 1 мл. Їх засівають у пробірку з 10 мл МПБ і в 10 пробірок з 1 мл аналогічного середовища так, щоб концентрація мікробів коливалась у межах 100-1000 клітин в 1 мл. Після добової інкубації при оптимальній температурі (37 °С) з 1-ої пробірки роблять висів по 0,1 мл на 10 чашок Петрі, які містять по 100 ОД стрептоміцину в 1 мл агару. Посів проводять за допомогою шпателя. Вміст інших десяти пробірок також засівають на аналогічні окремі чашки Петрі із стрептоміцином, кожну в об'ємі 0,1 мл, шпателем. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-20 год.
Висів мікробів із пробірки, де знаходилось 10 мл живильного середовища, не дає таких флуктуацій мутантів, оскільки клітини рівномірно розподіляються в живильному середовищі.
Моделювання трансформації в мікроорганізмів. У досліді використовується стрептоміциночутлива сінна паличка (Bac. subtilis Strs) і донорська ДНК аналогічного мікроба, яка має гени, що кодують стійкість клітини до антибіотиків.
У стерильну пробірку наливають 0,5 мл бульйонної культури штама-реципі- єнта Bac. subtilis і додають 0,5 мл донорської ДНК з концентрацією 1 мкг/мл. Суміш інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-30 хв, потім додають 0,5 мл розчину хлориду магнію для руйнування ДНК, що не встигла проникнути в клітину-реци- пієнт. Роблять серійні 10-кратні розведення трансформованої культури у стерильному ізотонічному розчині хлориду натрію до 10-5-10-6 і проводять посіви матеріалу в об'ємі 0,1 мл за допомогою шпателя паралельно на чашки без антибіотика і з 100 ОД/мл стрептоміцину.
Після інкубації протягом 18-24 год при температурі 37 °С оцінюють результати досліду, вираховуючи частоту трансформації.
Наприклад, після посіву штама-реципієнта, який було розведено в 10000 (10-5) разів, на поверхні середовища виросло 120 колоній бацил (1,2- 108/мл). Посів 0,1 мл нерозведеного рекомбінантного штаму на середовище із стрептоміцином дав ріст 60 колоній (6,0-102/мл). Отже, частота трансформації (ЧТ) дорівнюватиме :
ЧТ = ^ = 5 .10-6 1,2 • 108
Таким чином, генетичні феномени знаходять широке практичне застосування в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біо- технології, сільського господарства тощо.
Розділ 8