Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
микробиология.doc
Скачиваний:
97
Добавлен:
11.11.2019
Размер:
13.03 Mб
Скачать

Мікробіологічне дослідження трупа

Розтин і мікробіологічне дослідження загиблих тварин має велике, часом вирішальне діагностичне значення. Воно проводиться з метою виявлення і визна­чення локалізації збудника інфекційного захворювання. Трупний матеріал дослі­джують за допомогою бактеріоскопічних (вірусоскопічних) і бактеріологічних методів. Досліджуваний матеріал беруть під час розтину трупа, яке проводять, дотримуючись встановлених правил.

Розтин трупа та його мікробіологічне дослідження потрібно робити якомога скоріше після смерті. До цього його необхідно зберігати на холоді, оскільки мікро­флора кишечника при низькій температурі повільніше проникає в кров, тканини й паренхіматозні органи. Розтин трупа та забір матеріалу необхідно проводити в умовах, які виключають його забруднення сторонніми мікроорганізмами. Взятий матеріал до посіву не повинен контактувати з дезінфікуючими речовинами, а після посіву - знезаражуватись. Результати досліджень обов'язково протоколюються. Під час розтину трупа та дослідження його матеріалів необхідно абсолютно попе­редити всіляку можливість інфікування як самих працюючих, так і інших осіб, а також контамінації оточуючого середовища.

Тварин, що загинули від експериментальної інфекції, також досліджують з дотриманням правил асептики. При цьому використовують лише стерильні інструменти. Їх переносять із стерилізатора в склянку зі спиртом і ватою на дні, перед кожним використанням обпалюють на вогні.

Загиблу тварину захоплюють пінцетом, кладуть спиною донизу на дерев 'яну дощечку, вміщену в металеву клювету з дезрозчином. До дощечки її прикріплюють булавками або гострими гвіздочками за чотири лапки, широко розтягуючи її. Шкіру в місці розтину змочують дезінфікуючим розчином, щоб не розліталась шерсть, яка містить автохтонну мікрофлору. Трупи тварин, які загинули від чуми та інших особливо небезпечних інфекцій, перед розтином занурюють у керосин для інак­тивації комах - перенощиків хвороби. Перед першим розрізом шкіру ретельно протирають дезрозчином, спиртом або обпалюють полум'ям газового пальника.

Розтин і дослідження трупа тварини проводять у певній послідовності: спочат­ку розрізають і досліджують зовнішні покриви, потім грудну й черевну порожнини.

Розтин зовнішніх покривів починають з розрізу шкіри від нижньої щелепи до лобка, потім роблять бокові надрізи в напрямку до лапок. Шкіру відсепарову- ють і відкидають в обидва боки, відкриваючи всю передню поверхню тіла (рис .38). В підшкірній клітковині відмічають такі зміни як гіперемію судин, крововиливи, набряки, стан лімфатичних вузлів. При їх збільшенні або нагноєнні роблять по­сіви на живильні середовища та мазки-відбитки, притискаючи поверхню розрізу вузла до предметного скла.

Перед розтином грудної порожнини її відкриту від шкіри поверхню змочують спиртом і запалюють. Пінцетом захоплю­ють мечоподібний відросток, роблять по­перечний надріз під ним, вставляють но­жиці і проводять два бокові розрізи в місцях сполучення ребер із грудною кісткою. Утво­рений лоскут відкривають доверху й огля­дають легені та серце, відмічають наявність ексудату. Обов 'язково роблять посів крові з серця. Для цього розжареним скальпелем припікають стінку шлуночка або перед­сердь і в даній ділянці роблять прокол пас­терівською піпеткою з тонко відтягнутим у полум'ї пальника кінцем. Кров, що потра­пила в капіляр, сіють в цукровий бульйон і на агар, а із залишку роблять мазки. При по­требі проводять також посіви та роблять мазки-відбитки з легень, плеври та ексудату.

Рис. 38. Послідовні етапи розтину білої миші.

Розтин і дослідження черевної порож­нини проводять дуже обережно, щоб не по­шкодити кишечник. Черевну стінку захоп­

люють і трохи підіймають вверх, ножицями розрізають її від діафрагми до лобка і по два бокових надрізи в напрямку до лапок. Утворені лоскути відвертають в обидва боки. Оглядають внутрішні органи, відмічаючи в протоколі величину, колір і консистенцію печінки, селезінки, нирок, надниркових залоз, лімфатичних вузлів брижі та наявність ексудату.

В разі потреби роблять посіви тканин вказаних органів та ексудату. Для цьо­го припікають поверхню органа розжареним скальпелем і в цій ділянці проводять розріз. Бактеріологічною петлею з поверхні розрізу роблять зскрібок паренхіми і сіють на живильні середовища. Для виготовлення мазків-відбитків вирізають шматочок органа й поверхнею розрізу притискають до предметного скла, або роз­мазують по ньому тонким шаром.

Трупи тварин і залишки органів після бактеріологічного дослідження спа­люють або стерилізують. Якщо тварини загинули від особливо небезпечних інфекцій, їх розтини й посіви проводять у спеціальних режимних лабораторіях із дотриманням особливо пильних заходів безпеки.

Вирощування посівів, виділення чистих культур та визначення видів збуд­ників проводять за загально прийнятими методами.

Визначення вірулентності мікроорганізмів, смертельної дії екзотоксинів та ендотоксинів

Майже в усіх бактеріологічних лабораторіях в дослідах на тваринах часто визначають патогенні й вірулентні властивості збудників інфекційних захворю­вань. Патогенність - це потенційна здатність певного виду мікроорганізмів вик­ликати інфекційний процес. Вона не є абсолютною і стабільною. Ступінь або міру патогенності визначають вірулентністю. Для її кількісного визначення запропо­новані три умовні одиниці вірулентності.

  1. Dosis letalis minima (DLM) - мінімальна смертельна доза, тобто найменша кількість живих мікроорганізмів або найменша доза токсину, яка здатна виклика­ти загибель 95 % тварин стандартної маси і віку через певний проміжок часу. Ця величина відносна й залежить від виду тварин. DLM для мишей, щурів, гвінейсь­ких свинок і кроликів буде різною.

  2. Dosis certa letalis (DCL) - безумовно смертельна доза, яка викликає заги­бель 100 % взятих у дослід тварин; вона також є відносною.

  3. Dosis letalis50 (DL50) - кількість мікроорганізмів (або токсину), яка викли­кає загибель 50 % взятих у дослід тварин. Остання величина є статистично найбільш достовірною летальною дозою. Вона визначається на основі обробки конкретних результатів загибелі тварин за методом Ріда і Менча, у якому реалізу­ються кумулятивні принципи обліку результатів.

Інколи визначають і мінімальну інфікуючу дозу (ІД50), тобто найменшу кількість мікробів, яка викликає захворювання у 50 % заражених тварин.

Титрування мінімальних смертельних доз, як правило, проводять на білих мишах як найбільш доступних і дешевих тваринах (рідко на гвінейських свинках

і кроликах). Мікроби (токсини) вводять внутрішньоочеревинно або внутрішньо­венно. Щоб отримати стабільні результати використовують тварин стандартної маси і віку. Мишей відбирають масою 16-18 г, гвінейських свинок - 200-250 г, кроликів - 1500 г.

Завись бактерій для зараження готують із молодих агарових культур після 18-20 год їх вирощування в термостаті. Для цього в пробірку з культурою на ско­шеному агарі вносять 5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію й ретельно стру­шують. Частину густого змиву переносять в іншу пробірку такого ж діаметру як і пробірка зі стандартом мутності. Завись розводять 0,85 % розчином хлориду на­трію до мутності, яка відповідає вибраному стандартові.

Централізованим шляхом готують такі еталонні стандарти мутності: № 5 - на п'ять одиниць мутності, що відповідає 500 млн мікробів у 1 мл; № 9 - 900 млн мікробів у 1 мл; № 10 - 1 млрд мікробів у 1 мл; № 11 - 1,1 млрд мікробів у 1 мл. Виготовляють також стандарти мутності для коклюшних бактерій на 9, 10 і 11 млрд мікробів у 1 мл.

При визначенні вірулентності мікроорганізмів, як правило, виготовляють вихідну завись, в якій знаходиться 1 млрд бактерій в 1 мл. Тоді для введення миші 100 млн мікробів беруть 0,1 мл зависі, для введення 200 млн - 0,2 мл і т.д. Стан­дартизовані зависі готують так, щоб бажані дози бактерій містились в однакових об' ємах, а загальної кількості їх повинно вистачити на всю групу тварин (наприк­лад, по 0,2 мл на 4-6 тварин).

Через 24-48 год після зараження відмічають кількість тварин, що загинули в кожній групі і вираховують ОЬ50 за методом Ріда і Менча.

Наприклад, із наведених в таблиці даних видно, що ОЬ50 знаходиться між розведеннями зависі мікробів 10-5 і 10-6. Для точного підрахунку ОЬ50 визначають величину х, яку додають до логарифму того розведення, яке менше 50 % дози (у наведеному прикладі 5) за формулою:

А -50

X — •

А - В

де А - % тварин, які загинули від розведення менше 50 % (у даному випадку 66,7 %); В - % тварин, що загинули від розведення більше 50 % дози (за даними таблиці - 33,3 %). Підставивши у формулу отримані числові значення, одержимо

Обчислення БЬ,. за методом Ріда і Менча

X — 66,7 - 50 — 0,5. 66,7 - 33,3

Таблиця 11


Розведення зависі мікробів

Кількість заражених тварин

З них

% тварин, що загинули

загинуло

вижило

10-4

6

6

0

100

10-5

6

4

2

66,7

10-6

6

2

4

33,3

10-'

6

0

6

0

Отже, ОЬ50 відповідатиме розведенню зависі 10. Враховуючи, що при се­рійних розведеннях послідовно з пробірки в пробірку переноситься 0,1 мл матері­алу (тобто, додається до 0,9 мл ізотонічного розчину), в 1 мл вихідної зависі бак­терій міститься 106,5 ВЬ50.

Розділ 7 ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ

Генетика бактерій та вірусів - наука, що вивчає механізми успадковування генетичних ознак та їх фенотипові прояви. Генетичний апарат прокаріотів побу­дований із двоспіральної суперспіралізованої ДНК. Сукупність генів нуклеоїду і позахромосомних факторів зумовлює генотип бактерій, а фенотип - це індивіду­альний вияв генотипу в конкретних умовах існування.

Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову, або модифі­каційну та спадкову, або генотипову. Неспадкова мінливість виникає під впливом факторів зовнішнього середовища (зміна морфології клітини, поява L-форм тощо). Модифікаційні зміни нетривалі, після припинення дії агента вони зникають. При генотиповій мінливості різноманітні ознаки бактерій успадковуються. Ця мін­ливість виникає внаслідок мутацій, трансформацій, коньюгацій і трансдукцій.

Вивчення модифікаційної мінливості бактерій. Готують 2 чашки Петрі, одна з яких містить м'ясо-пептонний агар з 0,1 % фенолу, інша - звичайний МПА. На поверхню чашок засівають культуру Proteus vulgaris. Посіви інкубують у тер­мостаті при температурі 37 °С протягом доби. Потім вивчають особливості росту мікробів на поверхні агару, роблять мазки, забарвлюють їх за Грамом і розгляда­ють під імерсійним об'єктивом. На контрольному середовищі (МПА) вульгарний протей представлено невеликими грамнегативними паличками, які мають тенден­цію до повзучого росту по поверхні середовища. На агарі з фенолом спостері­гається тенденція до утворення ізольованих колоній, в мазках видно ниткоподібні форми бактерій, часом із колбоподібними потовщеннями на кінцях.

Фенол як фактор модифікаційної мінливості може викликати втрату рухли­вості протеїв. Для її перевірки добову культуру P. vulgaris засівають у дві про­бірки: одна з них містить звичайний МПБ (контроль), інша - 0,1 % феноловий МПБ. Через добу культивування при температурі 37 °С у висячій краплі перевіря­ють рухливість збудників.

У контрольній пробірці вони зберігають рухливість, у дослідній - мікроби нерухомі. Для доведення природи модифікаційної мінливості мікроби засівають на звичайний м'ясо-пептонний агар і після 18-24-годинного культивування пере­віряють біологічні ознаки, в яких у цьому випадку спостерігається реверсія.

Метод реплік для виявлення мутантів. На чашку Петрі із повноцінним м'ясо-пептонним агаром за добу до досліду засівають 0,1 мл добової бульйонної

культури E. coli, розведеної до 10-3 ступеня із розрахунку, щоб виросло 100 ко­лоній. На наступний день готують мінімальне живильне середовище, яке не містить ростових факторів для бактерій (глюкозо-сольовий агар), і чашку з повноцінним середовищем. Для досліду використовують штамп-реплікатор, який представляє собою дерев'яний або металевий циліндр товщиною до 1 см з діаметром дещо меншим, ніж чашка Петрі (рис. 39). Його робоча поверхня вкрита оксамитом, вор-

саланом або іншим матеріалом, що має дрібні ворсинки. Відкривають чашку Петрі, на якій виросли колонії мікроор­ганізмів (матрична чашка), і прикладають до неї штамп-реплікатор. Після цього пе­реносять колонії, які прикріпились до вор­синок, на дослідну і контрольну чашки Петрі (чашки-репліки) із відповідними се- Рис. 39. Метод реплік. редовищами. Необхідно звернути увагу на

точне фіксування положення штампа-ре- плікатора на матричній чашці і чашках-репліках. Після добової інкубації при тем­пературі 37 °С вивчають колонії, що виросли на чашках і підраховують їх кількість. Відмічають колонії мікроорганізмів, які не виросли на мінімальному живильному середовищі. Вони є ауксотрофними мутантами, тому що нездатні синтезувати відповідні ростові фактори.

Ідентичний експеримент можна поставити для виділення мутантів, які є ре­зистентними до антибіотиків, не потрапляючи попередньо під їх вплив (селекцій­на дія).

Флуктуаційний тест Лурія і Дельбрюка для виявлення частоти спон­танних мутацій. Для того, щоб виявити частоту спонтанних мутацій, які зумов­люють стійкість до стрептоміцину (Str варіанти), відбирають чутливий до цього антибіотика штам E.coli. З добової культури бактерій у стерильному ізотонічному розчині хлориду натрію готують суспензію клітин з концентрацією 1000-10000 клітин в 1 мл. Їх засівають у пробірку з 10 мл МПБ і в 10 пробірок з 1 мл аналогіч­ного середовища так, щоб концентрація мікробів коливалась у межах 100-1000 клітин в 1 мл. Після добової інкубації при оптимальній температурі (37 °С) з 1-ої пробірки роблять висів по 0,1 мл на 10 чашок Петрі, які містять по 100 ОД стреп­томіцину в 1 мл агару. Посів проводять за допомогою шпателя. Вміст інших деся­ти пробірок також засівають на аналогічні окремі чашки Петрі із стрептоміцином, кожну в об'ємі 0,1 мл, шпателем. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протя­гом 18-20 год.

Якщо стрептоміцинорезистентні кишкові палички утворюються тільки після контакту мікробів із антибіотиком протягом доби, то їх число повинно було б бути приблизно однаковим на всіх 20 чашках Петрі. В іншому випадку, за умови перед- існування антибіотикостійких варіантів (мутантних), на чашках виростає неодна­кова кількість колоній мікроорганізмів. Це є прояв коливань (флуктуацій) кількості мутантних клітин залежно від часу формування мутацій.

Висів мікробів із пробірки, де знаходилось 10 мл живильного середовища, не дає таких флуктуацій мутантів, оскільки клітини рівномірно розподіляються в живильному середовищі.

Моделювання трансформації в мікроорганізмів. У досліді використовуєть­ся стрептоміциночутлива сінна паличка (Bac. subtilis Strs) і донорська ДНК анало­гічного мікроба, яка має гени, що кодують стійкість клітини до антибіотиків.

У стерильну пробірку наливають 0,5 мл бульйонної культури штама-реципі- єнта Bac. subtilis і додають 0,5 мл донорської ДНК з концентрацією 1 мкг/мл. Суміш інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-30 хв, потім додають 0,5 мл розчину хлориду магнію для руйнування ДНК, що не встигла проникнути в клітину-реци- пієнт. Роблять серійні 10-кратні розведення трансформованої культури у стериль­ному ізотонічному розчині хлориду натрію до 10-5-10-6 і проводять посіви матеріалу в об'ємі 0,1 мл за допомогою шпателя паралельно на чашки без антибіотика і з 100 ОД/мл стрептоміцину.

Після інкубації протягом 18-24 год при температурі 37 °С оцінюють резуль­тати досліду, вираховуючи частоту трансформації.

Наприклад, після посіву штама-реципієнта, який було розведено в 10000 (10-5) разів, на поверхні середовища виросло 120 колоній бацил (1,2- 108/мл). Посів 0,1 мл нерозведеного рекомбінантного штаму на середовище із стрептоміцином дав ріст 60 колоній (6,0-102/мл). Отже, частота трансформації (ЧТ) дорівнюватиме :

ЧТ = ^ = 5 .10-6 1,2 • 108

Таким чином, генетичні феномени знаходять широке практичне застосуван­ня в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біо- технології, сільського господарства тощо.

Розділ 8