Нокардіоз

Нетиповий актиномікоз або нокардіоз - хронічне захворювання внутрішніх органів, в основному, легень, рідко шкіри і слизових оболонок; можливий розви­ток міцетоми стопи. Найчастішими збудниками є НосагЛа asteroides і NоеаМіа brasiliensis із родини ШосаМіасеае. Мікробіологічна діагностика проводиться так само, як і при актиномікозах. Матеріал для дослідження - харкотиння, гній із аб­сцесів і нориць, біоптати тканин.

Бактеріоскопія. Препарати-мазки забарвлюють за методом Грама і Ціля-Ніль- сена. При мікроскопії виявляють бацилярні і кокоподібні структури або скупчен­ня паличок, що галузяться, забарвлюються за Грамом у фіолетовий колір (рис. 80).

1 2 Рис. 80. N.Asteroides: колонії (1), ланцюжки і конідії в мазку (2).

При гістологічному дослідженні уражених тканин друз не знаходять. Для експрес-діагностики можна використати реакцію імунофлуоресценції.

Бактеріологічне дослідження. Нокардії вирощують в аеробних умовах. Клінічний матеріал сіють на середовище Сабуро, кров'яний і звичайний МПА. На 2-3 добу виростають дрібні воскоподібні колонії. Чисті культури ідентифікують за морфологічними особливостями, характером росту і біохімічними ознаками.

Можна поставити біологічну пробу на мишах і гвінейських свинках здебіль­шого при інтрацеребральному і внутрішньовенному способах зараження.

При необхідності провести серологічні дослідження ставлять реакції аглю­тинації, преципітації в гелі, зв'язування комплементу. Для діагностики міцетоми стопи використовують і реакцію імуноелектрофорезу.

Сифіліс та інші трепонематози

Сифіліс - хронічна інфекційна венерична хвороба людини, що має цикліч­ний прогресуючий перебіг, уражає шкіру, слизові оболонки, внутрішні органи і нервову систему. Збудником захворювання є Treponema pallidum.

Розрізняють три основні періоди розвитку сифілісу, методи лабораторної діаг­ностики яких мають свої особливості. У ранній період хвороби матеріалом для лабораторної діагностики служить виділення з твердого шанкеру, пунктат із лімфа­тичних вузлів, зскрібки з розеол, сифілід тощо. При вторинному і третинному періодах досліджують сироватку крові і ліквор.

У зв'язку з тим, що виділення чистих культур трепонем у звичайних бактеріо­логічних лабораторіях неможливе, під час первинного періоду хвороби (рідко пізніше) проводять бактеріоскопічний метод діагностики. Починаючи з вторин­ного періоду, використовують, в основному, серологічні методи.

Бактеріоскопічне дослідження. Перед взяттям патологічного матеріалу спо­чатку сифілітичну виразку протирають ватним тампоном, для видалення сально­го нальоту і контамінуючої мікрофлори. Потім дно твердого шанкеру подразню­ють скальпелем чи металевою лопаточкою або енергійно стискають виразку з боків пальцями в гумовій рукавичці до виділення ранового ексудату. При невеликій

кількості прозорої рідини її можна внести у краплю 0,85 % розчину хлориду на­трію. При неможливості взяти матеріал із дна шанкеру (фімоз, рубцювання вираз­ки тощо) проводять пункцію регіонарних лімфатичних вузлів.

Краплю рідини з виразки або пунктату наносять на тонке предметне скло (1,1-1,2 мм), накривають покривним скельцем і досліджують у темному полі зору (краще!), або за допомогою фазово-контрастного чи аноптрального мікроскопа.

Бліда трепонема у темному полі зору має вигляд злегка блискучої тонкої ніжної спіралі з крутими рівномірними округлими первинними завитками (рис. 81). Рухи її плавні, часом вона згинається під кутом. Та особливо характерні для неї маят­никоподібні коливання.

Збудник сифілісу необхідно відрізняти від Treponema refringens (що колонізує зовнішні ста­теві органи), яка товстіша, грубіша, з нерівномір­ними крупнішими завитками і має активні без­ладні рухи, але не згинається. Трепонеми фузосп- ірохетозного симбіозу відрізняються тонким рисунком, пологими завитками і безладним рухом.

При діагностиці ротового сифілісу бліду тре-

понему слід диференціювати і від зубних трепо-

нем, особливо Т. dentium, а також від Т. buccalis.

Першу з них взагалі важко відрізнити від сифілі- ^Рис■ ^{81 T} P^aUidum

.. _ . „ у темному полі зору.

тичноі. Вона, правда, коротша, має 4-8 гострих за-

витків, маятникоподібний рух відсутній. T. buccalis товстіша, має грубі первинні завитки і безладний рух.

При будь-яких сумнівах потрібно враховувати, що всі сапрофітні трепонеми, на відміну від блідої, добре фарбуються аніліновими барвниками. Вони не прони­кають у лімфатичні вузли, тому дослідження пунктатів має більшу діагностичну цінність. Виявлення у пунктаті лімфатичних вузлів типових трепонем беззапереч­но підтверджує діагноз сифілісу.

Отже, темнопольне дослідження надавленої краплі є найкращим методом виявлення збудника сифілісу. Його переваги полягають у тому, що матеріал дослі­джують швидко, а морфологія трепонем у живому стані найбільш характерна. Тушові мазки за методом Буррі тепер не використовують.

7

В разі неможливості провести дослідження в темному полі зору можна вико­ристати різні методи фарбування. Бліда трепонема погано сприймає анілінові барвники. Із багатьох запропонованих способів забарвлення кращі результати отри­мують при використанні фарбування за Романовським-Гімзою. Виготовлені мазки фіксують метиловим спиртом або в суміші Никифорова. Чіткіші результати отри­мують тоді, коли фарбу Романовського-Гімзи наливають під препарат. Для цього в чашку Петрі кладуть уламки сірників, на них вміщують предметне скло мазком донизу і наливають барвник до тих пір, поки він змочить мазок. Час забарвлення при цьому подвоюють. При мікроскопії бліді трепонеми мають ніжно-рожевий колір, а інші види трепонем забарвлюються в синій або синьо-фіолетовий колір.

Можна використовувати і метод сріблення за Морозовим. Трепонеми повністю зберігають свої морфологічні особливості і виглядають під мікроскопом коричне­вими або майже чорними. Але посріблені препарати довго не зберігаються. Ос­таннім часом методи фарбування трепонем застосовують рідко.

Якщо розпочато лікування сифілісу хіміопрепаратами, виявити збудник у патологічних матеріалах навіть за допомогою темного поля зору практично не вдається. При отриманні негативного аналізу його необхідно повторити.

Серологічна діагностика сифілісу. При проведенні серологічних реакцій тепер використовують такі уніфіковані в Україні методи досліджень: реакції зв'я­зування комплементу (РЗК), імунофлуоресценції (РІФ), іммобілізації трепонем (РІТ), мікрореакцію преципітації (МПР) та імуноферментний аналіз (ІФА).

Впродовж багатьох років основною й найбільш поширеною реакцією вважа­лась реакція зв'язування комплементу або реакція Вассермана (РВ, RW). Для її постановки використовують сироватку крові хворого на сифіліс і спинномозкову рідину при ураженні нервової системи.

Методика постановки реакції Вассермана не відрізняється від техніки прове­дення РЗК. Різниця лише в тім, що для РВ використовують не лише специфічний трепонемний, а й неспецифічний кардіоліпіновий антиген.

Взяття 5-10 мл крові з ліктьової вени проводять натщесерце або не раніше 6 год після прийому їжі. Не можна брати кров у хворих з підвищеною температу­рою, після вживання алкоголю і жирної їжі, у вагітних жінок за 10 днів до пологів і породіль. Добуту з крові сироватку прогрівають при температурі 56 °С протягом 30 хв для інактивації власного комплементу. РВ обов'язково ставлять із двома ан­тигенами: специфічним і неспецифічним.

Специфічний ультраозвучений трепонемний антиген готують із культур блідих трепонем (штам Рейтера), вирощених у пробірках і підданих дії ультразвуку. Його випускають у вигляді ліофільно висушеного порошку. Неспецифічний кардіоліпі- новий антиген готують шляхом спиртового екстрагування ліпідів із бичачого сер­ця і очищення від баластових сумішей, розфасовують в ампули по 2 мл. Для вве­дення антигену в РВ його титрують згідно з даною інструкцією. Безпосередньо перед постановкою РВ проводять титрування комплементу і гемолітичної сиро­ватки за такою ж схемою, як і в РЗК. Реакцію Вассермана ставлять як якісним, так і кількісним методом. Якісну реакцію проводять у трьох пробірках із двома анти­генами за звичайною схемою (табл. 61).

Результати реакції оцінюють за 4 плюсовою системою: позитивна реакція - коли є повна або значна затримка гемолізу (4+, 3+); слабопозитивна реакція - част­кова затримка гемолізу (2+); сумнівна реакція - незначна затримка гемолізу (1+). В разі виникнення повного гемолізу РВ вважають негативною (див. вкл., рис.23).

Кожну сироватку, що дала позитивну якісну реакцію, необхідно дослідити і кількісним методом з послідовним її розведенням від 1:10 до 1:640 (табл. 62).

Титром досліджуваної сироватки (титр реагінів) вважають те максимальне її розведення, при якому настає повна (4+) або значна (3+) затримка гемолізу. Кількісний метод постановки РВ має важливе значення для оцінки ефективності

Таблиця 61 Схема постановки якісної реакції Вассермана Компоненти, мл	Номер пробірки
	1	2	3 (контр.)
Інактивована сироватка хворого 1:5	0,25	0,25	0,25
Антиген трепонемний в робочій дозі	0,25	-	-
Антиген кардіоліпіновий в робочій дозі	-	0,25	-
Ізотонічний розчин хлориду натрію	-	-	0,25
Комплемент у робочому титрі	0,25	0,25	0,25
Струсити, поставити на 45 хв у термостат при 37 °С
Гемолітична система	0,5	0,5	0,5
Струсити, поставити на 45-60 хв у термостат при 37 °С

Таблиця 62 Компоненти, мл	Номер п						робірки
	1		2	3	4	5	6	7	8
Ізотонічний розчин хлориду натрію		0,25		0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Сироватка хворого, 1:5, інактивована		0,25^		^	^	^	^	^	^	-
Розведення сироватки		1:10		1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	-
Кардіоліпіновий антиген у робочій дозі		0,25		0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Комплемент у робочому титрі		0,25		0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Експозиція в термостаті 45 хв при 37 °С
Гемолітична система		0,50	0,50 0,50			0,50 0,50 0,50 0,50				0,50
Експозиція в термостаті 60 хв при 37 °С
Можливий результат		4+	4+ 4+			3+ - - -				-
У даному випадку титр сироватки 1:80

лікування сифілісу. Швидке зниження титру реагінів вказує на успішну терапію. Якщо ж титр сироватки довго не знижується, це свідчить про відсутність ефек­тивності застосованих препаратів і необхідність змінити тактику лікування.

При підозрі на серонегативний первинний сифіліс або прихований, третин­ний чи вроджений, рекомендують ставити реакцію Вассермана на холоді за тією ж схемою. В разі підозріння на нейросифіліс РВ проводять із спинномозковою рідиною, яку не інактивують, оскільки вона не містить власного комплементу. В реакцію вводять нерозведений ліквор і в розведеннях 1:2 і 1:5.

Реакція Вассермана стає позитивною через 2-3 тижні після появи твердого шанкру. При вторинному сифілісі вона випадає позитивною в 100 % випадків, у третинному - в 75 %.

Схема кількісного методу реакції Вассермана

Окрім того, в комплексі серологічних реакцій (КСР) як скринінг-тест викорис­товують мікрореакцію преципітації з плазмою крові або інактивованою сироваткою.

Мікрореакцію преципітації ставлять із кардіоліпіновим антигеном. Прин­цип реакції полягає в тому, що при додаванні до плазми або сироватки крові хво­рого на сифіліс емульсії кардіоліпінового антигену утворюється преципітат (ком­плекс антиген-антитіло), який осідає у вигляді пластівців білого кольору. Корис­туються такою методикою: у лунку пластини вносять піпеткою три краплі плазми (або інактивованої сироватки), потім додають одну краплю емульсії стандартного кардіоліпінового антигену. Компоненти реакції змішують струшуванням пласти­ни протягом 5 хв, після чого додають три краплі 0,9 % розчину хлориду натрію і залишають при кімнатній температурі ще на 5 хв. Обов'язково ставлять контроль із слабопозитивною сироваткою крові. Результати оцінюють неозброєним оком над штучним джерелом освітлення. При появі в лунці великих пластівців реакцію вважають позитивною (4+, 3+), середніх і дрібних - як слабопозитивну (2+, 1+). При негативному результаті преципітат не утворюється.

Мікрореакцію преципітації можна проводити і кількісним методом для вста­новлення титру преципітуючих антитіл і оцінки на цій основі ефективності ліку­вання. Більш високі титри МРП отримують з плазмою, ніж із сироваткою. За кор­доном аналогом МРП із сироваткою хворого є VDRL (Veneral disease research laboratory), а з плазмою - RPR (Rapid plasma reagin).

Реакція імунофлуоресценції (РІФ). До групи специфічних реакцій, які ши­роко вживаються для серологічної діагностики сифілісу, відноситься непряма ре­акція імунофлуоресценції. Як антиген, в ній використовують завись патогенних блідих трепонем штаму Нікольса із паренхіми яєчок кролика на 7-ий день після зараження. Реакцію ставлять у двох модифікаціях: РІФ-АБС і РІФ-200. У першо­му варіанті використовують сорбент антитіл (сонікат) - ультраозвучений трепо- немний антиген для РЗК. Його випускає Каунаське підприємство з виробництва бактерійних препаратів (Литва). При варіанті РІФ-200 сироватку хворого розво­дять у 200 разів з метою зняти вплив групових протитрепонемних антитіл.

Постановку РІФ-АБС проводять на тонких, добре знежирених предметних скельцях. На зворотному боці скелець склорізом позначено 10 кружечків, діамет­ром 0,7 см. У межах кружка на скло наносять антиген - завись блідих трепонем - у такій кількості, щоб у полі зору їх було 50-60. Мазки висушують на повітрі, фіксують над полум'ям і 10 хв в ацетоні. В окрему пробірку вносять 0,2 мл сор­бенту (сонікату) і 0,5 мл сироватки крові хворого, добре перемішують. Суміш на­носять на мазок (антиген) так, щоб рівномірно його покрити, витримують 30 хв у вологій камері при 37 °С (І фаза реакції). Після цього мазок промивають фосфат­ним буфером, висушують і наносять на нього антиглобулінову флуоресцуючу си­роватку на 30 хв, ставлять у вологу камеру при 37 °С (ІІ фаза). Препарат знову промивають фосфатним буфером, висушують і досліджують під люмінесцентним мікроскопом.

При позитивній реакції бліді трепонеми випромінюють золотаво-зелене сяй­во, при негативній - не світяться.

Техніка постановки РІФ-200 така сама, як і РІФ-АБС, тільки сироватку крові хворого попередньо розводять у 200 разів фосфатним буфером. При проведенні

реакції імунофлуоресценції з спинномозковою рідиною хворого на сифіліс нерво­вої системи використовують РІФ-ц і РІФ-10, тобто ліквор вводять у реакцію не- інактивованим і нерозведеним, або розведеним 1:10.

Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІТ) грунтується на феномені втра­ти їх рухливості у присутності іммобілізуючих протитрепонемних антитіл сиро­ватки хворого і комплементу в умовах анаеробіозу. Як антиген в реакції викорис­товують завись блідих трепонем із тестикулярної тканини кролика, зараженого лабораторним штамом Нікольса. Завись розводять стерильним 0,85 % розчином хлориду натрію так, щоб у полі зору було 10-15 спірохет.

Для проведення реакції в стерильній пробірці змішують 0,05 мл сироватки крові хворого, 0,35 мл антигену і 0,15 мл комплементу. Дослід супроводжують контролями сироватки, антигену і комплементу (табл. 63). Пробірки вміщують в анаеростат, створюють анаробні умови і витримують у термостаті 18-20 год при температурі 35 °С. Потім із кожної пробірки готують препарат надавленої краплі, підраховують не менше 25 трепонем і відмічають, скільки з них рухливих і скільки нерухливих. Відсоток специфічної іммобілізації блідих трепонем підраховують за такою формулою:

х=А-В. юс,

В

де Х - відсоток іммобілізації, А - число рухливих трепонем в контрольній пробірці, В - число рухливих трепонем у дослідній пробірці. Реакція вважається позитивною, коли відсоток іммобілізації становить 50 і більше, слабопозитивною - від 30 до 50, сумнівною - від 20 до 30 і негативною - від 0 до 20.

Постановка реакції іммобілізації трепонем (мікроанаеростатна методика)

Приклад позитивної РІТ:

Таблиця 63 Компоненти, мл	Номер пробірки
	дослід			контроль компонентів
	1 (дослідна)	2 (контрольна)	1		2	3	4	5
Досліджувана сироватка	0,05	0,05	-		-	-	-	-
Комплемент активний	0,15	-	0,15		0,15	0,15	-	-
Комплемент інактивований	-	0,15	-		-	-	0,15	-
Антиген	0,35	0,35	0,35		0,35	0,35	0,35	0,35
Позитивна сироватка	-	-	0,05		0,05	-	-	-
Негативна сироватка	-	-	-		-	0,05	0,05	-

У практичних лабораторіях використовують більш простий меланжерний метод РІТ за М.М. Овчинниковим. Анаеробні умови досліду створюються вміщен­ням реагуючої суміші (сироватки, антиген, комплемент) у меланжер, обидва кінці якого закривають гумовим кільцем. Меланжерна методика дозволяє обходитись без складного обладнання та апаратури для створення анаеробіозу, але дає такі результати, які не поступаються класичній мікроанаеростатній методиці.

Реакції іммобілізації трепонем та імунофлуоресценції вважають найбільш специфічними в серологічній діагностиці сифілісу. І все ж таки, РІТ, незважаючи на її специфічність, не рекомендують для використання в широкій практиці через трудомісткість постановки.

Імуноферментний аналіз (ІФА) проводять як із кадріоліпіновим антигеном (неспецифічна, відбіркова реакція), так і з трепонемним (специфічна реакція), яка підтверджує діагноз сифілісу.

Принцип непрямого методу ІФА полягає в тому, що до антигена, адсорбова­ного на твердій фазі в лунках планшети, вносять досліджувану сироватку. Якщо вона містить антитіла проти трепонем, утворюється комплекс антиген-антитіло (І фаза). Після відмивання незв'язаних неспецифічних антитіл у лунки вносять ан- тиглобулінову сироватку, кон 'юговану з ферментом (частіше всього з пероксида- зою хріну). Кон'югат міцно приєднується до комплексу антиген-антитіло (ІІ фаза).

Після відмивання незв'язаного кон 'югату в лунки додають забарвлюючий субстрат ОФД - ортофенілендіамін (ІІІ фаза). Пероксидазну реакцію зупиняють, додаючи сірчану кислоту. Для контролю ставлять такі ж проби з позитивною та завідомо негативною сироватками.

Облік результатів аналізу проводять за допомогою фотометра, який визначає оптичну густину в двохвильовому режимі (492 нм і 620 нм). Для постановки ре­акції ензиммічених антитіл, окрім фотометра, потрібні одно- та восьмиканальні автоматичні піпетки з поліпропіленовим наконечником і відповідні набори діаг­ностичних тест-систем.

Метод ІФА знаходить широке використання в серологічній діагностиці сифі­лісу. Він однаково ефективний для виявлення хвороби в інкубаційному періоді (через 1-2 тижні після інфікування), при клінічних проявах хвороби і прихованих її формах. Дуже часто ІФА використовують при скринінгових обстеженнях насе­лення, особливо на станціях переливання крові.

У лабораторній практиці інколи застосовують також реакцію імунного при­липання (РІП) та реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА). Перша з них грун­тується на тому, що патогенні тестикулярні трепонеми штаму Нікольса при змі­шуванні з сироваткою хворого в присутності комплементу і еритроцитів людини прилипають до поверхні червоних кров'яних тілець. РНГА досить широко вико­ристовується для діагностики сифілісу завдяки своїй методичній простоті. Вона стає позитивною вже через три тижні після зараження. Позитивний результат ре­акції залишається впродовж років після видужання. Аналогом цієї реакції за кор­доном є ТРНА (Treponema pallidum haemoagglutination).