Ранова анаеробна газова інфекція

Анаеробна газова інфекція (клостридіальний міозит, газова гангрена) - гостра, тяжка, поліетіологічна ранова інфекція, яку викликають бактерії роду Clostridium в асоціації між собою і умовно-патогенними мікроорганізмами. Основними збуд­никами захворювання є Clostridium perfrigens, C. novyi (oedematiens), C. septicum (див. вкл., рис. 17). Значно рідше зустрічаються C. histolyticum, C.sordellii, C. fallax. Із аеробних бактерій у рановому вмісті виявляють протей, стафілококи, кишкові палички та ін. C. perfrigens може викликати харчові токсикоінфекції.

В якості досліджуваного матеріалу беруть шматочки уражених тканин, рано­вий вміст, ексудат, випіт при набряках; при харчових токсикоінфеціях - блювотні маси, промивні води шлунка, випорожнення, кров, залишки підозрілої їжі. В разі необхідності досліджують перев'язувальний та шовний матеріал (шовк, кетгут), одяг, грунт, секційний матеріал (шматочки некротизованих тканин, печінки, селе­зінки). З метою попередження шкідливої дії кисню повітря на анаеробну мікро­флору тверді матеріали для дослідження краще брати у короткі пробірки, що гер­метично закриваються. Рідкі досліджувані матеріали можна набирати у шприц, на голку насадити гумовий корок і в такому вигляді транспортувати до лабо­раторії.

Мікробіологічна діагностика газової гангрени зводиться до виділення чис­тих культур збудників, їх ідентифікації на основі морфологічних, культуральних і біохімічних властивостей та визначення типів токсинів.

Бактеріоскопія є необхідним етапом для орієнтації в характері ранової мікрофлори. Для цього готують мазки-відбитки з уражених тканин, ексудату чи випоту, забарвлюють за Грамом або метиленовою синькою. Наявність у мазках великої кількості крупних грампозитивних паличок зі спорами чи капсулами (О. perfringens) або без них може служити ознакою можливого розвитку газової гангрени (рис. 75).

Рис. 75. C. Perfringens: 1 - вегетативні форми; 2 - капсули; 3 - спори.

З метою орієнтовної ідентифікації клостридій можна використати люмінес­центно-серологічний метод, коли мазки обробляють діагностичними флуоресцен­тними сироватками. За видом сироватки, яка викликає специфічне світіння навколо оболонок бактерій під люмінесцентним мікроскопом, визначають вид збудника.

Бактеріологічне дослідження. Рідкі досліджувані матеріали сіють у натив- ному вигляді. Шматочки уражених тканин та інші щільні матеріали спочатку го­могенізують у фарфорових ступках з піском, добавляючи рівний об'єм ізотоніч­ного розчину хлориду натрію. Будь-який матеріал розділяють на 2 частини; одну з них прогрівають 20 хв при 80 °С, другу не піддають термічній обробці. Обидві проби паралельно висівають на спеціальні сердовища для культивування анае­робних мікроорганізмів.

Для первинного накопичення анаеробів широко використовують середови­ще Кітта-Тароцці. На ньому C. perfringens росте з інтенсивним помутнінням і бурх­ливим газоутворенням. Інші види утворюють помутніння і менше виділення газу або без нього (C. histolyticum). При посіві на стерильне знежирене лакмусове молоко C. perfringens вже через 4-5 год викликає його звудження з утворенням цегляного кольору губчастого згустка, який газ підіймає на поверхню пептонізованої рідини.

Класичним середовищем для отримання ізольованих колоній є кров'яний цукровий агар Цейслера (до МПА додають 1,5 % дефібринованої крові і 2 % глю - кози). Чашки з посівами вирощують в анаеростаті. На цьому агарі колонії основ­них збудників мають гладеньку дископодібну форму сіруватого кольору з рівними або бахромчастими краями і піднятим центром, оточені зоною гемолізу (рис. 76).

На середовищі Вілліса-Хоббса (МПА з лакто­зою, індикатором нейтральним червоним, яєчним жовтком і знежиреним молоком) колонії C. perf­ringens червоного кольору і зоною опалесценції; колонії C. novyi безбарвні (не розкладають лакто­зи), але із зоною опалесценції; колонії С. septicum червоні; навколо колоній C. histolyticum є зона про­світлення.

Колонії C. histolyiticum, С. sordellii безбарвні, а ореол опалесценції мають лише колонії C. sor­dellii. На кров'яному агарі з бензидином колонії C. novyi чорніють після перебування на повітрі.

При посіві матеріалу уколом у стовпчик агару Вільсона-Блера вже через 3-4 години в ділянках росту C. perfringens середовище чорніє. Характерні особли­вості росту на молоці і середовищі Вільсона-Блера використовують для експрес- діагностики газової гангрени, викликаної C. perfringens.

Колонії, що виросли на диференціально-діагностичних середовищах, мікро­скопують, пересівають на середовище Кітта-Тароцці, отримують чисту культуру й ідентифікують її за морфологічними, культуральними і біохімічними властиво­стями. Важливе значення має визначення типів екзотоксинів.

При відсутності анаеростатів та інших приладів для створення анаеробних умов ізольовані колонії, а отже й чисті культури, можна отримати шляхом посіву різних розведень досліджуваного матеріалу у трубки Віньяль-Вейона за методом Вейнберга. Матеріал розводять 1:10, 1:100, 1:1000 у розтопленому і охолоджено­му до 45 °С цукровому агарі, розлитому в пробірки по 10 мл. Із кожного розведен­ня агар натягують у трубки, а капілярний кінець запаюють на вогні. Після інку­бації при 37 °С трубки розпилюють надфілем, стовпчик агару з характерними колоніями анаеробів виштовхують у стерильну чашку Петрі. Потім колонії пет­лею пересівають у середовище Кітта-Тароцці, вирощують чисті культури й іден­тифікують їх.

У ряді розвинутих країн оранізовані спеціальні лабораторії, в яких викорис­товують сучасні апарати і тест-системи для культивування й ідентифікації ана­еробів, а також бокси, де всі посіви, пересіви та інші маніпуляції проводять при повній відсутності кисню повітря.

Однак у рутинних бактеріологічних лабораторіях виділення і повну ідентифі­кацію чистих культур проводять рідко, оскільки весь процес займає багато часу, вимагає складних і дорогих живильних середовищ та спеціальних приладів. У зв'язку з цим для більш швидкої діагностики анаеробної газової інфекції і вибору відповідних лікувальних антитоксичних сироваток проводять визначення типів екзотоксинів за допомогою реакції нейтралізації in vivo.

Рис. 76. Зони гемолізу навколо колоній C. perfringens.

Біологічні дослідження. Для постановки тесту нейтралізації використову­ють видові діагностичні антитоксичні сироватки, центрифугати (фільтрати) буль­йонних культур і білих мишей, масою 16-18 г. У 6 пробірок вносять по 0,9 мл

центрифугату, потім у 5 з них добавляють по 0,6 мл антитоксичних сироваток до основних видів збудників (табл. 55). У 6-у пробірку вносять 0,6 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (контроль). Суміші витримують у термостаті протягом 40 хв і кожну з них в об'ємі 0,5 мл вводять внутрішньовенно двом мишам. Видову належність культури (токсину) визначають за мишами, що вижили, при загибелі тварин контрольної та інших дослідних груп.

У лабораторіях, де є можливості працювати з культурами тканин, реакцію ней­тралізації ставлять на трипсинізованих клітинах 10-12 денних курячих ембріонів.

Токсигенність можна визначити ще на етапі росту ізольованих колоній. Для цього колонію емульгують на склі у краплі акридинового оранжевого, накрива­ють покривним скельцем і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. На­явність тільки зелених паличок свідчить про їх токсигенність. Червоні або зелені з червоними фрагментами бактерії виявляють при слабкій продукції токсинів або при повній їх відсутності.

Можна встановити вид і тип токсину в реакції преципітації на склі у агарово­му гелі з фільтратом та відповідними антисироватками в реакції гальмування in vitro специфічними антитілами лецитиназної чи лейкотоксичної активності фільтратів або ранових ексудатів.

Ще швидше і точніше встановлюють види збудників газової гангрени за до­помогою газової хроматографії, яка дозволяє визначати їх за якісним і кількісним вмістом насичених і ненасичених жирних кислот.

Діагностику харчових токсикоінфекцій, викликаних C. perfringens типів А і С, проводять за допомогою бактеріологічного дослідження з метою виділення збуд­ника, визначення масивності контамінації ним харчових продуктів і типу токсинів.

Виділення чистих культур проводять так само, як і при анаеробній газовій інфекції (висів матеріалу на середовища Цейслера, Вілліса-Хобса або в трубки Віньяль-Вейона, отримання ізольованих колоній, чистих культур, ідентифікація).

Таблиця 55

Схема постановки реакцій нейтралізації на білих мишах

№ пробірок	Центри- фугат культури, мл	Антитоксичні сироватки					0,85% розчин NaCl
		C.perf- ringens	C.novyi	C.septicum	C.sordellii	C.histo- lyticum
1	0,9	0,6 мл 50М0
2	0,9		0,6 мл 50М0
3	0,9			0,6 мл 100М0
4	0,9				0,6 мл 100М0
5	0,9					0,6 мл 100М0
6	0,9							0,6 мл

При цьому обов'язково сіють10 мл крові хворого в 150-200 мл середовища Кітта- Тароцці з метою виділення C. perfringens. Із фільтратом культури важливо поста­вити реакцію нейтралізації на мишах для визначення типу екзотоксину.

Важливо провести і кількісний мікробіологічний аналіз. Для цього дослі­джуваний матеріал розводять у пептонній воді від 10^-1 до 10^-10 і по 1 мл кожного розведення засівають у розтоплене і охолоджене до 45 °С середовище Вільсона- Блера. Через 6-8 год інкубації при температурі 45-46 °С (або 20 год при 37 °С) відбирають ті проби, в яких виросло 10-30 колоній, і обчислюють кількість бак­терій в 1 мл посівного матеріалу, враховуючи ступінь розведення і посівну дозу.

Для швидкого виявлення C. perfringens досліджуваний матеріал сіють у про­бірку з лакмусовим молоком. Через 4-5 год відбувається характерне утворення губчастого згустка і просвітлення сироватки.

Діагноз харчової токсикоінфекції встановлюють тоді, коли виявляють значне обсіменіння (10⁶ і більше в 1 г) тих продуктів, що спричинили захворювання, виді­ляють C. pergringens типів А і С і відповідні екзотоксини, або ж висівають з крові хворого C. perfringens будь -якого серотипу ( A, B, C, D, E, F).

Діагностика псевдомембранозного коліту. C. difficile є частим нозокоміаль- ним патогеном, який у 90-100 % випадків викликає це захворювання на фоні нераці­ональної терапії антибіотиками (ампіцилін, кліндаміцин, цефалоспорини). Вказані препарати викликають глибокий дисбаланс мікрофлори кишечника і колонізацію слизової C. difficile. Бактерії продукують 2 види токсинів - ентеротоксин (токсин А) і цитотоксин (токсин В).

Лабораторний діагноз псевдомембранозного коліту потребує взяття псевдо­мембран при колоноскопії і виділення збудника з біоптатів слизової оболонки сліпої кишки або випорожнень. C. difficile висівається майже від усіх хворих за допомо­гою тих же методів, що і при інших анаеробних інфекціях. "Золотим стандартом" є цитотоксичний тест: фільтрат фекалій або культури вносять у флакон з моноша­ром культури клітин, в результаті цього виникає цитопатична дія, що нейтралі­зується специфічною антисироваткою. На жаль, він досить громіздкий і забирає багато часу.

Швидка латекс-аглютинація застосовується часто, але вона не є високо-спе­цифічною і часто дає хибно-позитивні і хибно-негативні результати. Більш точним і високоспецифічним є імуноферментний аналіз, який дає змогу надійно виявляти цитотоксин і ентеротоксин C. difficile.