Методи ідентифікації вірусів

Важливим етапом лабораторної діагностики будь-якої вірусної інфекції є виявлення та типування вірусів у досліджуваному матеріалі, яке передбачає вико­ристання специфічних противірусних сироваток.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячо­му ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних анти­генів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використову­ють забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі проми­вають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формалі­ном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, про­гріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими

.Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антиге­на, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу ан­тигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО - гемаглютинуюча одиниця - макси­мальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію ерит­роцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про не­гативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді "ґудзика" на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглю­тинації утворюється осад у вигляді кільця (див. вкл., рис. 27).

Для постановки реакції з метою визначення невідомого вірусу або його анти­генів у буферному розчині (0,2) роблять двократні розведення імунної сироватки (вихідне розведення 1:10), а потім додають невідомий антиген в об'ємі 0,2 мл (4-8 ГАО). Систему інкубують залежно від властивостей вірусу при температурі 4 °С, 18 °С, 37 °С 1-18 год. Потім до комплексу додають подвійний об'єм зависі еритроцитів. Пробірки або пластини інкубують протягом 1-3 год при тій самій температурі до повного осідання еритроцитів і оцінюють результати. Реакцію вва­жають позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів. РГГА широко вико­ристовують для ідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності ад­сорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з по­верхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв' язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше, 0,4-1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які вико­ристовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецеп­тори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубу- ють протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль викори­стовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед дослідом з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають по 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні пробірки вно­сять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. Пробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали клітини, при кімнатній температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після цьо­го пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування ерит­роцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність ад­сорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному середовищі, при негативній - вони адсорбуються на кліти­нах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, рес- піраторно-синцитіальних вірусів та ін.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфіч­них антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації остан­нього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопа- тичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшко- утворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі системи - курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компо­нентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна рідина, інфіковані або дез- інтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних власти­востей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин ИеЬа, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-8. По 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура клітин. Перед проведенням досліду в пробірках замі­нюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з культу - рою клітин для кожного розведення вірусмісткого матеріалу. Контролем є культу­ри клітин, які не інфікують вірусом. Клітинні культури інкубують при 37 °С про­тягом 5-7 днів. Результати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають 50 % тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД₅₀), тобто найбільше розведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями імунної си­роватки, куди вносять стандартну дозу вірусу (найчастіше 100 ТЦД₅₀), а після інку­бації при кімнатній температурі протягом 30-60 хв додають одношарові культури клітин. Систему інкубують при 37 °С протягом одного тижня і враховують на­явність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про нейтралізацію віру­су, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах.

Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на солом'яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірусміст- кого матеріалу, який містить 100 ТЦД^, з різними розведеннями специфічної про­тивірусної імунної сироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при температурі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з індикатором фенолро- том і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають резиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім читають результати. При позитивному тесті в дослідних пробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо вимірюючи значен­ня рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу особливо часто вико­ристовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

Надійним методом ідентифікації вірусів є реакція нейтралізації бляшкоут- ворення вірусів у культурах клітин. Принцип реакції полягає в тому, що антитіла специфічної імунної сироватки, які нейтралізують віруси, сприяють зменшенню числа бляшок - зон некрозів - в одношаровій культурі клітин.

Для постановки реакції на одношарову культу клітин у чашках або матрацах наносять суміш вірусів і специфічної імунної сироватки, які попередньо інкубо- вані при 37 °С протягом 1 год для нейтралізації. Після цього поверхню моношару клітин заливають освітленим індиферентним агаром у суміші з усіма необхідни­ми компонентами і суправітальним барвником нейтральним червоним. Заражені клітини інкубують у вологій камері в атмосфері з 5 % вуглекислого газу протягом 5 діб при температурі 37 °С.

Більш чутливим методом вивчення утворення бляшок є використання бенто­нітового покриття. Цей метод набув широкого застосування при вивченні ентеро- вірусів. Особливість його полягає в тому, що заражені сумішшю вірусів та імун­ної сироватки моношарові культури клітин заливають рідким живильним середо­вищем, яке містить гель бентоніту. Часточки бентоніту адсорбуються на поверхні культур клітин і гальмують вільне поширення вірусів серед клітин. Вже через 2 дні після зараження з'являються вірусні бляшки у вигляді прозорих плям на молочно-матовому фоні моношару клітин (див. вкл., рис. 28).

Про нейтралізуючу активність сироватки свідчить зменшення числа та вели­чини бляшок, які утворюються під агаровим покриттям у порівнянні із контролем без специфічної сироватки. Реакцію вважають позитивною, якщо число бляшок або їх величина зменшились на 80 % у порівнянні з контролем. Нейтралізуючим титром сироватки є те її найбільше розведення, при якому ще спостерігають ней­тралізацію вірусів, що попереджує утворення бляшок в культурі клітин.

При постановці реакції нейтралізації в курячих ембріонах або лабораторних тваринах їх заражають сумішшю вірусмісткого матеріалу та специфічної імунної сироватки. При обліку результатів враховують кількість загиблих ембріонів чи тварин, утворення зон некрозів на хоріоналантоїсній оболонці курячих ембріонів або оцінюють ступінь нейтралізації вірусів за їх, наприклад, гемаглютинуючою активністю. РН часто застосовують для лабораторної діагностики герпесу, грипу, парагрипу, паротиту, поліомієліту тощо.

Реакцію зв'язування комплементу досить широко використовують у віру­сологічній практиці для ідентифікації хвороботворних агентів. Вона належить до непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взає­модії комплементу із специфічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок цього не відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів.

Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна імунна сироват­ка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та електроліт. Зважа­ючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед постановкою основного досліду обов'язково титрують для визначення робочих доз інгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують вірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. Після інкубування цієї першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані гемолітичною сиро­ваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних пробірок при від­повідній температурі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною сироват­кою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне додавання ге­молітичної системи (при відсутності вільного комплементу) не супроводжується лізисом еритроцитів - позитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетеро- логічними, вільний комплемент зв'язується із сенсибілізованими еритроцитами барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою системою: від "++++" - різко позитивна реакція (прозо­ра рідина і осад еритроцитів) до "-" - негативна реакція (відсутність осаду ерит­роцитів, повний гемоліз або "лакова кров").

До особливостей РЗК при вірусологічних інфекціях належить те, що її мож­на ставити як при температурі 37 °С (інкубуючи систему "антиген - антитіло - комплемент" протягом 1 год), так і на холоду (+4 °С протягом 18 год), а також використовуючи мікрометод, коли всі інгредієнти реакції беруться в об'ємі не 0,5 мл, а 0,25 мл. РЗК використовують майже при всіх вірусних інфекціях.

У реакціях імунодифузії використовують принцип дифундування антигенів і антитіл назустріч один одному в напіврідкому середовищі, наприклад, агарово­му гелі. У зоні оптимальних співвідношень антигенів та антитіл утворюються лінії преципітації. Їх число залежить від кількості антигенів, які відрізняються своїми епітопами, так як кожна лінія відповідає своїй системі антиген - антитіло.

Реакцію ставлять, як правило, на стерильному склі, яке покривають 1 % ага- розою. Після застигання в ній роблять лунки. У центральну лунку вносять спе­цифічну противірусну сироватку, а лунки навколо заповнюють матеріалом, який містить віруси. Систему інкубують у вологій камері протягом 24-48 год. Поява ніжних ліній преципітації свідчить про наявність вірусного антигена.

Тест є більш чутливим при поєднанні із електрофорезом. Метод зустрічного імуноелектрофорезу найчастіше використовують для визначення HВsAg вірусу ге­патиту В або інших вірусних антигенів, які мають негативний заряд. Сутність цього методу полягає в тому, що на скляну пластинку наносять шар агарози, в якому після застигання роблять паралельні ряди лунок. Антиген наливають у лунки, які роз­ташовані ближче до катоду, а сироватки - в лунки поблизу аноду. Після цього пласти­ни кладуть у вологі камери і пропускають постійний електричний струм. Вірусні ан­тигени з негативним зарядом рухаються в напрямку до аноду, а антитіла сироватки - до катоду. Через 24 год в агаровому гелі спостерігають появу ліній преципітації, які утворюються в зонах, що містять еквівалентні концентрації антигенів і антитіл

.Метод імунної електронної мікроскопії (ІЕМ) дозволяє визначити комплек­си, які утворюються внаслідок взаємодії вірусних антигенів із специфічними ан­титілами сироваток. У багатьох випадках цей метод є більш ефективним, ніж ви­користання звичайної електронної мікроскопії. Для реалізації методу матеріал, який містить віруси, змішують з імунною сироваткою, інкубують протягом 1 год при температурі 37 °С, потім 8-12 год при 6 °С. Комплекси вірусів з антитілами осаджують при ультрацентрифугуванні. Після промивання осаду до нього дода­ють 3 % вольфрамово-оцтову кислоту або ураніл-ацетат. Встановлюють відповід­не значення рН, наносять матеріал на спеціальну мідну сітку і вивчають під елек­тронним мікроскопом, спостерігаючи наявність агрегації вірусів, навантажених антитілами. ІЕМ використовують для виявлення та ідентифікації вірусів гепатиту А і В, поліомієліту, цитомегалії, ротавірусного ентериту тощо.

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) набув широкого застосування у вірусології внаслідок високої специфічності та зручності в користуванні. Існують численні модифікації цього методу. Зокрема, можна виявляти та ідентифікувати віруси як безпосередньо в досліджуваному матеріалі, так і після попереднього зараження ними, наприклад, культур клітин. Принцип методу полягає у взаємодії антигенів з антитілами, які заздалегідь мічені флуорохромами (родаміном, який дає люмінесценцію червоного кольору, або флуоресцеїнізотіоцианатом натрію, який зумовлює зелене світіння комплексу в ультрафіолетових променях). Метод непрямої імунофлуоресценції можна ефективно використовувати для ідентифі­кації більшості вірусів.

При непрямому методі дослідження культуру клітин, яка розташовується моношаром на предметних скельцях, попередньо заражають досліджуваним ма­теріалом, що містить віруси, та інкубують при оптимальних параметрах протягом декількох днів. Після цього скельця фіксують в ацетоні та наносять на них спе­цифічну сироватку. Систему інкубують у вологій камері при температурі 37 °С протягом 30 хв, відмивають від надлишку сироватки і наносять тонкий шар флуо­ресціюючої антисироватки. Після 30 хвилинного контакту скельця відмивають для видалення надлишку антитіл, підсушують і досліджують під люмінесцент­ним мікроскопом, спостерігаючи характерне світіння.

При реакції радіального гемолізу відбувається взаємодія вірусних антигенів, які адсорбовані на еритроцитах, суспендованих в агарозному гелі, з антитілами, що внесені в лунки і дифундують в шар агару. При цьому утворюються специфічні імунні комплекси на поверхні еритроцитів. У присутності комплементу спостері­гається лізис еритроцитів і, відповідно, утворення зон гемолізу навколо лунок. Реакцію оцінюють за допомогою стереоскопічної лупи. При позитивному тесті діаметр зони гемолізу навколо лунки може досягати 2 мм і більше. При відсут­ності гемолізу або його діаметрі менше 2 мм реакцію розцінюють як негативну. Вважається, що за своєю чутливістю ця реакція не поступається РГГА.

Реакція зворотної непрямої гемаглютинації використовується у вірусо­логічній практиці для виявлення невідомих вірусних антигенів. Сутність її поля­гає в тому, що еритроцити тварин або людини, навантажені специфічними проти­

вірусними антитілами, здатні взаємодіяти з вірусними антигенами, внаслідок чого вони склеюються і випадають в осад.

Таким чином, компонентами реакції є еритроцити, оброблені таніновою кис­лотою з адсорбованими на них молекулами противірусних антитіл (сенсибілізо­вані еритроцити), вірусні антигени і розчин електроліту.

Реакцію можна ставити в пробірках, лунках, на склі, в капілярах, а також мікрометодом.

Для постановки реакції досліджуваний матеріал (0,025 мл) розводять дво­кратно електролітом, після чого додають такий самий об'єм еритроцитарного анти- тільного діагностикуму. Експозиція відбувається протягом 30 хв при температурі 37 °С після чого проводять облік реакції.

При позитивній реакції в дослідних лунках спостерігають виражену аглюти­націю еритроцитів з утворенням осаду з нерівними хвилястими краями, який розпо­діляється рівномірним шаром по дну пробірки або лунки - "перевернута парасоль­ка". При негативному результаті - щільний, компактний осад з рівними краями.

Крім цих реакцій для виявлення та типування вірусів широко використовують РЕМА, РІА, полімеразну ланцюгову реакцію та інші, викладені у попередніх розділах.