5. 4. Применение генетических методов в диагностике инфекционных болезней

1. Метод молекулярной гибридизации

Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Он применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического поло­жения Метод основан на способности двунитевой ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатури­ровать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении тем-ДНК гена

3

■5'

*r

3*

5* у

"" fill Праймеры

у

5^r

ли

Д

.ИГ

.5’

НК- полимераза ♦ А.Г.Ц.Т

5*'

ш

5’

I

5'

Рис. 5.3. Полимеразная цепная реакция

1 — денатурация ДНК; 2 — связывание праймеров с комплементарными уча­стками гена, образование репликативной вилки; 3 — добавление ДНК- полимеразы и нуклеотидов, синтез гена; 4 — повторение цикла.

пературы на 10 °С вновь восстанавливать исходную двунитевую структуру. Метод требует наличия молекулярного радиоактивно­го зонда. Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеи­новой кислоты, меченная радионуклидами, с которой сравни­вают исследуемую ДНК

Для проведения молекулярной гибридизации молекулу ис­следуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специ­альном фильтре, который помещают в раствор, содержащий ра­диоактивный зонд. Создаются условия, благоприятные образо­ванию двойных спиралей При наличии комплементарности между’ зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двой­ную спираль.

2. Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в последнем ДНК микроба без выделения этого микроба в чистую культуру

.

Для осуществления этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, а наличие возбудителя определяют по обнаруже­нию в выделенной ДНК специфичного для искомого микроба гена. Для обнаружения гена его накапливают. Для этого необхо­димо иметь праймеры, комплементарные З'-концам ДНК искомо­го гена. Накопление (амплификация) гена осуществляется следую­щим образом. Выделенную из иссл дуемого материала ДНК нагре­вают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют прай­меры, затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом прай­меры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками. Добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. При температуре, оптимальной для функционирова­ния ДНК-полимеразы, нуклеотиды присоединяются к 3 концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяют снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз в 2 раза (рис.5.3). Реакцию проводят в специальных приборах — амплификаторах. ПЦР применяют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

Глава 6. Биотехнология. Генная инженерия

1. Предмет и задачи биотехнологии

Биотехнология (от греч. bios — жизнь, tecen — искусство, logos — наука) — это область знаний, которая на основе изучения биологических процессов, протекающих в живых организмах и системах, использует эти процессы, а также сами биообъекты (главным образом бактерии, вирусы, грибы, растительные и животные клетки) для получения в промышленных условиях необходимых ценных для человека продуктов или создания процессов и материалов, ранее не встречавшихся в природе.

Биотехнология — это наиболее быстро развивающаяся наука, которая на ближайшие десятилетия будет определять уровень научно-технического прогресса всего человечества. Связано это с тем, что она решает такие важные проблемы, как: создание принципиально новых эффективных и экономичных техноло­гий получения необходимых в жизни человека веществ и ма­териалов, в том числе медикаментозных средств; создание но­вых сложных материалов; осуществление процессов, ранее не­известных в природе; поиски оригинальных путей решения экологической безопасности на планете и новых источников энергии; повышение продуктивности сельскохозяйственных растений и животных и тд

В соответствии с этими задачами биотехнология как единая область знания подразделяется на медицинскую, сельскохозяй­ственную, промышленную и экологическую. Медицинская био­технология решает следующие задачи:

а) создание профилактических, диагностических и лечебных препаратов на основе современных экономичных и эф­фективных технологий с использованием биообъектов (микробные, растительные и животные клетки, органы животных, растения) и продуктов их жизнедеятельности (первичные и вторичные метаболиты). Это прежде всего создание и производство антибиотиков, вакцин, витами­нов, гормонов, иммуномодуляторов, антигенов, антител, нуклеиновых кислот, диагностических систем, иммуноком- петентных клеток, препаратов крови и др.;

б) разработка и использование в практике новых приборов, аппаратуры, а также материалов, восполняющих дефек­ты в работе отдельных органов и тканей человека. В ка­честве примера можно привести создание искусственной кожи из культуры клеток эпидермиса для восполнения дефектов при ожогах; создание искусственной почки, сердца и других органов; восстановление работы иммун­ной системы с помощью пересадки иммунокомпетент- ных клеток и т.д.;

в) разработка на основе знаний о геноме человека проблем генодиагностики, генотерапии и генопрофилактики наслед­ственных и других заболеваний путем пересадки генов;

г) создание принципиально новых методов для проведения лабораторных и клинических анализов с помощью био­сенсоров. Принцип работы биосенсоров сводится к реги­страции точными и чувствительными приборами (детек­торами) физических, химических и биологических эф­фектов взаимодеиствия биореагентов (например, фермен­тов, антител, антигенов) с клетками или молекулами- мишенями, т.е. с определяемым детектируемым веществом. Например, взаимодействие антигенов со специфическими антителами может сопровождаться экзотермической реак­цией, которая улавливается точными приборами, и по силе этой реакции можно судить о количественных характери­стиках ее компонентов.

Сельскохозяйственная биотехнология наряду с разработкой и производством диагностических, профилактических и лечебных ветеринарных препаратов интенсивно занимается проблемами повышения урожайности, продуктивности животноводства пу­тем выведения с помощью генной инженерии новых сортов ра­стений и пород животных (трансгенные животные).

Экологическая биотехнология разрабатывает биологические си­стемы деградации и обезвреживания вредных химических ве­ществ, загрязняющих почву, водоемы, атмосферу. Например, уже получены штаммы микроорганизмов, утилизирующих нефть и нефтепродукты на водных поверхностях, фенол — в сточных водах и т. д.

Учитывая важность биотехнологии на современном этапе существования человечества в ее развитие вкладываются огром­ные средства. Более половины этих средств идет на развитие медицинской биотехнологии, так как она решает основные проблемы жизнеобеспечения человека.

2. История биотехнологии

Биотехнология возникла давно. Уже до нашей эры человек научился выпекать хлеб, получать молочно-кислые продукты, вино, пиво с помощью биотехнологических процессов броже­ния, ферментации. Естественно, что эта деятельность человека носила сугубо эмпирический характер.

Только в XIX в. великии французский ученый JI.Пастер открыл микробную (ферментативную) природу брожения. С этого вре­мени биотехнология стала на научный путь развития, a JI.Па­стера можно считать основоположником биотехнологии. Иногда период, связанный с открытием JT.Пастера, называют этиологи­ческим [Блинов Н.П., 1989]. Дальнейший прогресс биотехноло­гии связан с достижениями микробиологии, химии, генетики, молекулярной биологии, иммунологии, химической технологии.

Большую роль в развитии биотехнологии сыграла техничес­кая микробиология. Разработка промышленных способов куль­тивирования микробов позволила получать разнообразные меди­цинские препараты, пищевые продукты (сахар, сиропы, дрож­жи), многие химические вещества (спирт, уксусная кислота, ацетон и др.). Одним из важных этапов развития биотехнологии явились использование культур животных и растительных кле­ток, разработка способов их промышленного культивирования. Наконец, венцом современной биотехнологии стала генетичес­кая и белковая инженерия, которые позволили получать раз­нообразные биологически активные вещества, используя реком­бинантные штаммы бактерий и вирусов, а также синтез их в бесклеточной системе.