Глава 3. Физиология микробов

Физиология микробов — раздел микробиологии, изучающий жизнедеятельность микробов, процес­сы их питания, обмена, дыхания, роста, размно­жения, закономерности взаимодействия с окружа­ющей средой.

Выяснение физиологии микробов важно для понимания пато­генеза, постановки микробиологического диагноза, проведения лечения и профилактики инфекционных заболеваний, регуля­ции взаимоотношений человека с окружающей средой и т.д.

1. Физиология бактерий

Бактерии отличаются своеобразным химическим составом, раз­нообразными типами питания, способами получения энергии, быстрым размножением, высокой приспособляемостью и устой­чивостью ко многим факторам окружающей среды.

1. Химический состав бактерий

В состав бактерий, как и других микробов, входят вода, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, минеральные веще­ства

Вода — основной компонент бактериальной клетки, состав­ляющий около 80 % ее массы. В спорах количество воды умень­шается до 18—20 %. Вода является растворителем для многих веществ, а также выполняет механическую роль в обеспечении тургора. При плазмолизе — потере клеткой воды в гипертони­ческом растворе — происходит отслоение протоплазмы от кле­точной оболочки. Удаление воды из клетки (высушивание) при­останавливает процессы метаболизма. Большинство бактерий хорошо переносит высушивание, но при недостатке воды они не размножаются. Высушивание в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) также прекращает размножение и способствует длительному сохранению бактерий.

Белки составляют 40—80 % сухой массы бактерий. Они оп­ределяют важнейшие биологические свойства бактерий. Молеку­лы этих белков обычно состоят из сочетаний 20 остатков обыч­ных аминокислот. Кроме того, в состав бактерий входит диа- минопимелиновая кислота (ДАП), отсутствующая в клетках человека и животных. Бактерии содержат более 2000 различных белков, находящихся в структурных компонентах и участвую­щих в процессах метаболизма. Большая часть белков обладает ферментативной активностью. Белки бактериальной клетки обус­ловливают антигенность и иммуногенность, вирулентность, видовую принадлежность бактерий.

Нуклеиновые кислоты бактерий выполняют функции, анало­гичные таковым нуклеиновых кислот эукариотических клеток: молекула ДНК в виде хромосомы обусловливает наследствен­ность, РНК (информационная, или матричная, транспортная и рибосомная) участвуют в биосинтезе белка.

Бактерии можно характеризовать (таксономически) по со­держанию суммы гуанина и цитозина (Г и Ц) в молярных про­центах (М%) от общего количества оснований ДНК. Более точной характеристикой микроорганизмов является гибридизация их ДНК. Основой метода гибридизации ДНК является способность денатурированной (однонитевой), «расплетенной» ДНК ренату- рироваться, т.е. соединяться с комплементарной нитью ДНК и образовывать двухцепочечную молекулу ДНК.

Углеводы бактерий представлены простыми веществами (моно- и дисахаридами) и комплексными соединениями. Полисахариды часто входят в состав капсул. Некоторые внутриклеточные по­лисахариды (крахмал, гликоген и др.) являются запасными пи­тательными веществами клетки.

Липиды входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, а также клеточной стенки бактерий, например наружной мембраны, где, кроме бимолекулярного слоя липи­дов, имеется ЛПС. Липиды могут выполнять в цитоплазме роль запасных питательных веществ. Липиды бактерий представлены фосфолипидами, жирными кислотами и глицеридами. Наиболь­шее количество липидов (до 40 %) содержат микобактерии ту­беркулеза.

Минеральные вещества бактерий обнаруживают в золе после сжигания клеток. В большом количестве выявляются фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, а также мик­роэлементы (цинк, медь, кобальт, барий, марганец и др.). Они участвуют в регуляции осмотического давления, pH среды, окис- лительно-восстановительного потенциала, активируют фермен­ты, входят в состав ферментов, витаминов и структурных ком­понентов микробной клетки. Например, железо входит в состав ферментов, участвующих в окислительно-восстановительных ре­акциях; магний — в состав рибосом.

2. Питание бактерий

Питательные субстраты поступают внутрь бактериальной клетки через всю ее поверхность, обеспечивая высокую скорость про­цессов метаболизма и адаптацию к меняющимся условиям ок­ружающей среды.

Типы питания. Широкому распространению бактерий способ­ствует разнообразие типов их питания. Микроорганизмы нуж­даются в углероде, азоте, сере, фосфоре, калии и других эле­ментах. По источникам углерода для питания бактерии делят на аутотрофы (от греч. autos — сам, trophe — пища), использу­ющие для построения своих клеток диоксид углерода С0₂ и другие неорганические соединения, и гетеротрофы (от греч. heteros — другой, trophe — пища), питающиеся за счет готовых органических соединений. Аутотрофными бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве, серобакте­рии, обитающие в воде с сероводородом, железобактерии, живущие в воде с закисным железом и др. Гетеротрофы, ути­лизирующие органические остатки отмерших организмов в окружающей среде, называются сапрофитами. Гетеротрофы, вызывающие заболевания у человека или животных, относят к патогенным и условно-патогенным. Среди патогенных микробов встречаются облигатные и факультативные паразиты (от греч. parasitos — нахлебник). Облигатные внутриклеточные паразиты способны существовать только внутри клетки (например, рик­кетсии, вирусы и некоторые простейшие).

В зависимости от окисляемого субстрата, называемого доно­ром электронов или водорода, микробы делят на две группы. Микробы, использующие в качестве доноров водорода неорга­нические соединения, называют литотрофными (от греч. lithos — камень), а микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения, — органотрофами. По ис­точнику энергии бактерии делятся на фототрофы, т.е. фотосин­тезирующие (например, сине-зеленые водоросли, использующие энергию света), и хемотрофы, нуждающиеся в химических источниках энергии.

Факторы роста. Для роста микробов на питательных средах необходимы определенные дополнительные компоненты, соеди­нения, которые сами микробы синтезировать не могут, поэтому эти вещества надо добавлять в питательные среды. Такие соеди­нения называются факторами роста. К факторам роста относят: аминокислоты, необходимые для построения молекул белков, пурины и пиримидины — для образования нуклеиновых кис­лот, витамины, входящие в состав некоторых ферментов. По отношению к факторам роста различают ауксотрофы и прото- трофы. Ауксотрофы нуждаются в одном или нескольких фак­торах роста, прототрофы могут сами синтезировать нужные для роста соединения из глюкозы и солей аммония.

Механизмы питания. Проникновение различных веществ в бак­териальную клетку зависит от величины и растворимости их молекул в липидах или воде, pH среды, их концентрации, проницаемости мембран и др. Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы и ионы, задерживая макромолекулы с относительной молекулярной массой более 600. Основным регу­лятором поступления веществ в клетку является цитоплазмати­ческая мембрана. Условно можно выделить 4 механизма проник­новения питательных веществ в бактериальную клетку: простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, транс­локация групп.

Простая диффузия — наиболее простой механизм поступле­ния веществ в клетку: перемещение веществ происходит вслед­ствие разницы их концентрации по обе стороны цитоплазмати­ческой мембраны. Вещества проходят в основном через липид­ную часть цитоплазматической мембраны (органические моле­кулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам и цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты энергии.

Облегченная диффузия происходит также в результате разни­цы концентрации веществ по обе стороны цитоплазматической мембраны. Однако этот процесс осуществляется с помощью мо- лекул-переносчиков, локализующихся в цитоплазматической мем­бране и обладающих определенной специфичностью. Каждый пе­реносчик транспортирует через мембрану соответствующее ве­щество или передает его другому компоненту цитоплазматичес­кой мембраны — собственно переносчику. Белками-переносчи- ками могут быть пермеазы, место синтеза которых — цитоплаз­матическая мембрана. Облегченная диффузия протекает без зат­раты энергии, вещества перемещаются в направлении от более высокой концентрации к более низкой.

Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и на­правлен на перенос веществ в направлении от меньшей кон­центрации в сторону большей, т.е. как бы против «течения», поэтому этот процесс сопровождается затратой метаболической энергии — АТФ, образующегося в результате окислительно-вос­становительных реакций в клетке.

Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспор­том, отличаясь тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется.

Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем.

3. Ферменты бактерий

Ферменты — белки, участвующие в процессах анаболизма (син­теза) и катаболизма (распада), т.е. в метаболизме. Ферменты распознают соответствующие им метаболиты (субстраты), всту­пают с ними во взаимодействие и ускоряют химические ре­акции.

Известно более 2000 ферментов. Они объединены в 6 клас­сов: 1) оксидоредуктазы — окислительно-восстановительные фер­менты (к ним относят дегидрогеназы, оксидазы и др.); 2) транс- феразы, переносящие отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим; 3) гидролазы, ускоряющие реакции гидролиза, т.е. расщепление веществ на более простые с при­соединением молекулы воды (эстеразы, фосфат азы, глюкозида- зы и др.); 4) лиазы, отщепляющие от субстратов химические группы негидролитическим путем (карбоксилазы и др.); 5) изо- меразы, превращающие органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза и др.); 6) лигазы, или синтетазы, уско­ряющие синтез сложных соединений из более простых (аспара- гинсинтетаза, глутаминсинтетаза и др.).

Многие ферменты взаимосвязаны со стр 'ктурами микробной клетки. Например, в цитоплазматической мембране имеются окис­лительно восстановительные ферменты, участвующие в дыха­нии и делении клетки, ферменты, обеспечивающие питание клетки, и др. Окислительно-восстановительные ферменты ци­топлазматической мембраны и ее производных обеспечивают энергией интенсивные процессы биосинтеза различных струк­тур, в том числе клеточной стенки. Ферменты, связанные с делением и аутолизом клетки, обнаруживаются в клеточной стенке. Так называемые эндоферменты катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки. Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду, расщепляя макромолекулы питательных субстратов до простых соединений, которые усваиваются клет­кой в качестве источников энергии, углерода и др. Некоторые экзоферменты инактивируют антибиотики (пенициллиназа и др.), выполняя защитную функцию.

Различают конститутивные и индуцибельные ферменты. К кон­ститутивным ферментам относят ферменты, которые синтези­руются клеткой непрерывно, независимо от наличия в пита­тельной среде соответствующего субстрата. Индуцибельные (адап­тивные) ферменты синтезируются бактериальной клеткой толь­ко при наличии в среде субстрата данного фермента. Например, р-галактозидаза кишечной палочкой на среде с глюкозой прак­тически не образуется, но ее синтез резко увеличивается при выращивании палочек на среде с лактозой или другим галак- тозидом.

Некоторые ферменты (так называемые ферменты агрессии) разрушают ткань и клетки, обусловливая широкое распростра­нение в инфицированной ткани микробов и их токсинов. К таким ферментам относят гиалуронидазу, коллагеназу, ДНКа­зу, нейраминидазу, лецитовителлазу и др. Так, гиалуронидаза стрептококков, расщепляя гиалуроновую кислоту соединитель­ной ткани, способствует распространению стрептококков и их токсинов

Ферменты микроорганизмов используют в генетической ин­женерии (рестриктазы, лигазы и др.) для получения различных биологически активных веществ, а также важных продуктов в легкой, пищевой и других отраслях промышленности, медици­не, ветеринарии и сельском хозяйстве. Ферменты применяют в качестве биодобавок в стиральные порошки для уничтожения органических загрязнений.

Различия в ферментном составе используют для идентифи­кации бактерий, поскольку они обусловливают различные био­химические свойства бактерий: сахаролитические (расщепление сахаров), протеолитические (разложение белков) и другие, вы­являемые по конечным продуктам расщепления (образование ще­лочей, кислот, сероводорода, аммиака и др.). Сахаролитические свойства определяют на дифференциально-диагностических пи­тательных средах Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева и др. Среды Гисса (пестрый ряд) состоят из мясопептонного бульона или полужидкого мясопептонного агара с добавлением какого-либо углевода (лактозы, маннита и др.) и индикатора, меняющего цвет при расщеплении углевода с кислотообразованием. Если бактерии расщепляют углевод с образованием кислоты и газа, цвет среды изменяется, появляются пузырьки газа. Набор сред Гисса применяют для идентификации возбудителей.

Среды Эндо и Левина представляют собой мясопептонный агар с лактозой и индикатором pH. Среду разливают в чашки Петри.

Бактерии, расщепляющие лактозу с кислотообразо­ванием (лактозоположительные), образуют колонии, окрашенные в красный цвет с металлическим блес­ком на среде Эндо или в темно-синий на среде Левина в зависимости от характера индикатора. Бактерии, не расщепляющие лактозу (сальмонеллы, дизентерий­ные палочки), на этих средах образуют неокрашен­ные (лактозонегативные) колонки.

Протеолитические свойства бактерий определяют по разжиже­нию желатина и продуктам разложения белка (в мясопептонном бульоне и др.) — индола, сероводорода, аммиака. С этой целью делают посев «уколом» в столбик желатина и в мясопептонный бульон с индикаторами продуктов расщепления белка.

4. Дыхание бактерий

Дыхание, или биологическое окисление, основано на окисли­тельно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ — универсального аккумулятора химической энергии. Энер­гия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановле­ния: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление — присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород — такое ды­хание называется аэробным, а если акцептором служат нитрат, сульфат, фумарат, то такое дыхание называется анаэробным (нитратным, сульфатным, фумаратным). Анаэробиоз (от греч.

отрицательная приставка — an + aeros — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода.

Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называ­ется брожением. При брожении происходит фермен­тативное расщепление органических соединений (пре­имущественно углеводов) в анаэробных условиях. По конечному продукту расщепления углеводов различа­ют спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и дру­гие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на 3 основные группы: облигатные, т.е. обязательные аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы. Об­лигатные аэробы могут расти только при наличии кислорода. Облигатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангре­ны, столбняка, бактероиды и др.) растут на среде без кисло­рода, который для них токсичен. При наличии кислорода бак­терии образуют перекисные радикалы кислорода, в том числе перекись водорода и супероксид-анион кислорода, токсичные для анаэробных бактерий, поскольку они не образуют соответ­ствующие инактивирующие ферменты или эти ферменты не активны. Аэробные бактерии инактивируют перекись водорода и супероксид-анион соответствующими ферментами (каталазои, пероксидазой и супероксиддисмутазой). Факультативные анаэро­бы могут расти как при наличии, так и отсутствии кислорода, поскольку они способны переключаться с дыхания в присут­ствии молекулярного кислорода на брожение в отсутствие мо­лекулярного кислорода. Факультативные анаэробы способны к анаэробному дыханию, называемому нитратным: нитрат, явля­ющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекуляр­ного азота и аммиака.

Среди облигатных анаэробов выделяют аэротолерантные бак­терии, которые растут при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.

Для выращивания анаэробов используют анаэростаты — спе­циальные емкости, в которых воздух заменяется смесью газов, не содержащих кислорода. Воздух можно удалять из питательных сред путем кипячения, с помощью химических адсорбентов кислорода, помещаемых в анаэростаты или другие емкости с посевами.