6. Основные методы изучения морфологии микробов

Микробы — существа, размеры которых ниже разрешающей способности глаза. Поэтому важными методами их исследования являются микроскопические, позволяющие изучать морфологию и структуру микробов. Среди микроскопических методов исполь­зуют: 1) обычную световую микроскопию (светопольную), тем­нопольную, фазово-контрастную, ультрафиолетовую (люминес­центную); 2) электронную микроскопию и ее разновидности.

Световой микроскоп состоит из механической и оптической частей. Механическая часть представлена ножкой (или башмаком), тубусо- держателем, тубусом, предметным столиком. В нижней части тубу- содержателя находятся макро- и микровинты для грубой и тонкой подачи тубуса. Верхняя часть тубусодержателя снабжена головкой крепления револьвера для объективов. Оптическая часть микроскопа состоит из объектива, окуляра и осветительного аппарата. Объекти­вы делятся на сухие и иммерсионные (погружные). Сухой объектив — это такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассмат­риваемым препаратом находится воздух. Из-за разницы показателей преломления предметного стекла и воздуха часть световых лучей не попадает в глаз наблюдателя.

Особенность микроскопирования микробов — применение ис­ключительно иммерсионной системы, состоящей из исследуемо­го объекта, иммерсионных масла и объектива. Преимущество этой системы заключается в том, что между объектом на предметном стекле и фронтальной линзой объектива находится среда с одинаковым показателем преломления (кедровое, вазелиновое масло и др.). Благодаря этому достигается наилучшее освещение объекта, так как лучи не преломляются и попадают в объектив.

При обычной световой микроскопии наблюдаемый объект (в том числе и микробы) рассматриваются в проходящем све­те. Поскольку микробы, как и другие биологические объекты малоконтрастны, то для лучшей видимости их окрашивают.

С целью расширения границы видимости применяют другие виды световой микроскопии. Темнопольная микроскопия — метод микроскопического исследования объектов, не поглощающих свет, плохо видимых при методе светлого поля. При темнопольной мик­роскопии объекты освещаются косыми лучами или боковым пуч­ком света, что достигается при помощи специального конденсора

• так называемого конденсора темного поля. При этом в объек­тив микроскопа попадают только лучи, рассеянные объектами, находящимися в поле зрения Поэтому наблюдатель видит эти объекты ярко светящимися на темном фоне. Темнопольную мик­роскопию применяют для прижизненного изучения трепонем, лептоспир, боррелий, жгутикового аппарата бактерий.

Фазово-контрастная микроскопия — метод микроскопичес­кого наблюдения прозрачных, неокрашенных, не поглощаю­щих света объектов, основанный на усилении контраста изоб­ражения. Прозрачные неокрашенные объекты (в том числе живые микроорганизмы) отличаются от окружающей среды по пока­зателю преломления, не поглощают свет, но изменяют его фазу. Эти изменения не улавливаются глазом. При фазово-контрас­тной микроскопии свет, не поглощенный объектом, проходит через так называемое фазовое кольцо, нанесенное на одну из линз объектива. Фазовое кольцо смещает фазу этого проходя­щего света на четверть длины волны и снижает его интенсив­ность. Прохождение прямого, не поглощенного объектом света через фазовое кольцо обеспечивается кольцевой диафрагмой конденсора. Лучи, даже немного отклоненные (рассеянные) в препарате, не попадают в фазовое кольцо и не претерпевают сдвига фазы. В результате разность фаз между отклоненными и неотклоненными лучами усиливается, давая контрастное изоб­ражение структуры препарата. Фазово-контрастную микроско­пию используют для прижизненного изучения бактерий, гри­бов, простейших, клеток растений и животных.

Люминесцентная микроскопия (флюоресцентная микроско­пия) — метод световой микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов. Люминесценция (от лат. lumen, luminis — свет) — особый вид свечения, которое возбуждается коротковолновой частью види­мого света либо ультрафиолетовыми лучами.

Для люминесцентной микроскопии применяют либо специ­альные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обыч­ным «биологическим» микроскопам. Люминесцентная микроско­пия нашла широкое применение в микробиологической диагно­стике, помогает проводить ускоренную идентификацию микро­бов. Первичная (собственная) люминесценция характерна для ряда биологически активных веществ (ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А и B_v тетрациклины и др.). Вторичная (или наведенная) люминесценция возникает в резуль­тате обработки исследуемого объекта светящимися красителями — флюорохромами (акридиновый оранжевый, ФИТЦ, бромид эти- дия и др.). Среди различных видов люминесцентной микроско­пии наиболее распространены прямое флюорохромирование — окрашивание флюорохромами и иммунофлюоресценция (РИФ).

Люминесцентная микроскопия окрашенных флюорохромами фиксированных препаратов используется для обнаружения мико­бактерий, гонококков, возбудителя дифтерии, малярии в мазках крови и др. Этот метод более чувствителен по сравнению с обычны­ми методами окраски (например, окраски по Цилю— Нельсену).

Иммунофлюоресценция (метод Кунса) — сочетание микроско­пического метода с иммунологическим (см.раздел 9.11.4).

Электронная микроскопия — метод морфологического анали­за с помощью потока электронов. Роль оптических линз выпол­няют электрические и магнитные поля. Использование в каче­стве источника излучения потока электронов повышает разре­шающую способность микроскопа, измеряемую в нанометрах. Такая высокая разрешающая способность позволяет изучать структуру этих объектов (в том числе и микробов) на субкле­точном и макромолекулярном уровне. Электронная микроскопия применяется для изучения субмикроскопической анатомии ви­русов, бактерий, грибов, простейших. Метод используется для выявления вирусов с диагностической целью, например рота­вирусов в фильтратах фекалий. Использование электронной микроскопии в сочетании с иммунологическими методами обусловило развитие иммуно-электронной микроскопии. Иммун­ная электронная микроскопия сыграла большую роль при ис­следовании гепатитов А и В, вирусных гастроэнтеритов.