2. Особенности физиологии грибов и простейших

Грибы по типу питания — гетеротрофы, по отношению к кислороду — аэробы и факультативные анаэробы. Растут в широких диапазонах температур (оптимальная температура 25— 30 °С), имеют половой и бесполый способы размножения. Поэтому грибы широко распространены в окружающей среде, особенно в почве. Грибы вместе с сине-зелеными водорослями образуют симбиоз в виде лишайника. В этом симбиозе грибы поглощают воду и растворимые в ней вещества, а сине зеленые водоросли поставляют грибам органические соединения. Другой вид взаимоотношений — микориза — симбиоз грибов и корней высших растений.

Грибы культивируют в течение нескольких суток на сусле- агаре или жидком сусле, среде Сабуро, Чапека и др. Для этой цели можно использовать лабораторных животных.

Некоторые грибы обладают диморфизмом, т.е. способностью образовывать нитчатые и дрожжевые формы в зависимости от условий роста. Дрожжеподобные формы часто образуются in v/vo, т.е. при инфицировании человека грибами.

Простейшие имеют органы движения (жгутики, реснички, псевдоподии), питания (пищеварительные вакуоли) и выделе­ния (сократительные вакуоли). По типу питания они могут быть гетеротрофами или аутотрофами. Размножаются бесполым и по­ловым путем. Некоторые простейшие имеют сложный жизнен­ный цикл, сопровождающийся сменой форм развития, полово­го и бесполого размножения, образуют цисты.

Многие простейшие (дизентерийная амеба, лямблии, трихо- монады, лейшмании, балантидии) могут расти на питательных средах, содержащих нативные белки и аминокислоты. Для их культивирования используются также культуры клеток, кури­ные эмбрионы и лабораторных животных.Вирусы — облигатные внутриклеточные паразиты. В вирусинфи- цированной клетке вирус может воспроизводиться в виде многочисленных вирионов или находиться в интегрированном состоянии с хромосомой клетки, или быть в цитоплазме в виде кольцевых нуклеиновых кислот, напоминающих плазмиды бак­терий. Поэтому диапазон нарушений, которые вызывает вирус, весьма широк: от выраженной продуктивной инфекции завер­шающейся гибелью клетки, до продолжительного взаимодей­ствия вируса с клеткой, выражающегося в виде латентной инфекции или злокачественной трансформации клетки.

1. Культивирование и индикация вирусов

Вирусы культивируют на биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развиваю­щихся куриных эмбрионах и культурах клеток (тканей).

Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают иссле­дуемым вируссодержащим материалом различными способами. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вирусов, ус­танавливают на основании развития типичных признаков забо­левания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет имеющегося на поверхности вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят вне организма — в пробирках (in vitro), по сути она не является иммунологической реакцией. Использование животных для куль­тивирования вирусов в диагностических целях в настоящее время весьма ограничено.

Развивающиеся 5—12-дневные куриные эмбрионы заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша (рис.3.3). Индикацию вирусов осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА. Методику культиви­рования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц широко используют при промышленном выращивании вирусов.

Наиболее часто для культивирования вирусов применяют куль­туру клеток (тканей). Югетки, полученные из различных орга­нов и тканей человека, животных, птиц и других биологичес­ких объектов, способны размножаться вне организма на искусст­венных питательных средах в специальной лабораторной посуде

Рис. 3.3. Строение куриного эмбриона и способы его заражения.

1 — в амнион; 2 — в аллантоисную полость; 3 — в желточный мешок

(«матрасы», флаконы, пробирки и др.). Большое распростране­ние получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих более ак­тивной по сравнению с нормальными клетками взрослого орга­низма способностью к росту и размножению.

В зависимости от техники приготовления различают сле­дующие культуры клеток: 1) однослойные — клетки способ­ны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла лабораторной посуды в виде монослоя (рис.3.4,а); 2) суспензионные — клетки размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании; 3) органные — цельные кусочки органов и тканей, сохраня­ющие исходную структуру вне организма (применяются огра­ниченно).

По числу жизнеспособных генераций культуры клеток под­разделяют на: 1) первичные, способные размножаться только в первых генерациях, т.е. в нескольких пассажах после выделения из тканей; 2) перевиваемые, или стабильные, способные раз­множаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет) посредством постоянного пассирования; 3) полуперививаемые, имеющие ограниченную продолжительность жизни (40—50 пассажей). Первичные культуры клеток получают путем разрушения протеолитическими ферментами межклеточ­ных связей в тканях и органах до образования изолированных клеток. Многие первичные культуры (в основном опухолевые

Рис. 3.4. Однослойная культура клеток, а — незараженная; б — зараженная (ЦПЭ).

и

Рис. 3.5. Типы вирусных включений, а — цитоплазматические, б — ядерные.

Рис. 3.6. Бляшкообразование в культуре клеток.

ли эмбриональные) в дальнейшем сохраняют стабильную жиз­неспособность при многократном пассировании в лабораторных условиях — это перевиваемые или полуперевиваемые культуры клеток.

Выращенные культуры клеток (главным образом однослой­ные) заражают вируссодержащим материалом.

Индикацию вирусов в культуре клеток проводят на основании следующих феноменов: цитопатогениого действия (ЦПД) вирусов, или цитопатического эф­фекта (ЦПЭ), образования внутриклеточных вклю­чений, образования бляшек, гемадсорбции или «цвет­ной» реакции.

ЦПД, или ЦПЭ — видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до их отторжения от стекла, которые возникают в результате внутриклеточной репродукции вирусов (рис.3.4,б). Включения — скопление вирусных частиц или от­дельных компонентов вирусов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании (рис.3.5). Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовиру­сы — внутриядерные включения.

Бляшки, или «негативные» колонии — ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые невооруженным гла­

зом как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток (рис.З 6). Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. «Негативные» колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциа­ции вирусов, а также для определения их концентрации в исследуемом материале.

Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфи­цированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. «Цветная» реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирова­ния. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые про­дукты, что ведет к изменению pH среды и соответственно цвета индикатора. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.

2. Репродукция вирусов

Различают три типа взаимодействия вируса с клет­кой: 1) продуктивный, или цитоцидный тип, при котором в зараженных клетках образуется новое поколение вирионов (рис.3.7); 2) абортивный тип, характеризующийся прерыванием инфекционного процесса в клетке, поэтому новые вирионы не образуются; 3) интегративный тип, или вироге- ния, заключающийся в интеграции, т.е. встраива­нии вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместном сосуществовании.

Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой осуществ­ляется в результате размножения, т.е. репродукции вируса (от англ. reproduce — воспроизводить). Репродукция вируса проходит несколько стадий: 1) адсорбция вирионов на клетке; 2) про­никновение вирусов в клетку; 3) «раздевание» и высвобожде­ние вирусного генома (депротеинизация вирусов); 4) биосинтез компонентов вируса; 5) формирование вирусов — «сборка»; 6) выход вирионов из клетки. У различных вирусов эти стадии отличаются.

Адсорбция вирионов. Первая стадия заражения клетки начи­нается с адсорбции, т.е. с прикрепления вириона к поверхности клетки. Вирусы избирательно поражают определенные клетки, проявляя так называемый тропизм (греч. tropos — поворот, направление). Например, вирусы, репродуцирующиеся (размно­жающиеся) преимущественно в клетках печени, называются гепатотропными, а в нервных клетках — нейротропными и т.д.

1

Рис. 3.7. Стадии репродукции вирусов.

1 — адсорбция вириона на клетке; 2 — проникновение вириона в клетку путем виропексиса; 3 — вирус внутри вакуоли клетки; 4— “раздевание” вируса; 5 — репликация вирусной нуклеиновой кислоты в ядре (а) или цитоплазме (б) клетки; 6 — синтез вирусных белков на рибосомах клетки; 7 — формирование вириона; 8 — выход вириона из клетки путем почкования.

Адсорбция обеспечивается взаимодействием прикрепительных белков поверхностных структур вирионов со специфическими рецепторами чувствительных клеток. Такими рецепторами для миксовирусов являются мукопротеиды клеток, а для арбовиру- сов — липидные структуры клеток.

Проникновение в клетку. Вирусы проникают в клетку путем или виропексиса, или слияния оболочки вируса с клеточной мем­браной, или же в результате сочетания этих двух механизмов. При виропексисе (рецепторном эндоцитозе) вирус захватывает­ся, как бы заглатывается клеткой, происходят впячивание кле­точной мембраны, поглощение вириона и образование внутри­клеточной вакуоли, содержащей вирус. Вирионы, имеющие белок слияния, проникают в клетку через плазматическую мембрану в результате слияния с ней поверхностных структур вириона.

«Раздевание» вириона. Оно происходит в процессе проникно­вения вириона в клетку. В результате депротеинизации удаляют­ся поверхностные структуры вируса и высвобождается его внут­ренний компонент, способный вызывать инфекционный про­цесс. «Раздевание» вириона происходит с участием ферментов клетки. Конечными продуктами «раздевания» являются сердце- вина, нуклеокапсид и нуклеиновая кислота вириона.

Биосинтез компонентов вируса. Следующей стадией репродук­ции является биосинтез белков и нуклеиновых кислот вируса, который разобщен во времени и пространстве. Биосинтез осу­ществляется в разных частях клетки, поэтому такой способ размножения вирусов называется дисъюнктивным (от лат. disjunctus— разобщенный). Белки вируса синтезируются в ре­зультате транскрипции, т.е. «переписывания» информации с генома вируса на информационную РНК (иРНК) и последующей транс­ляции (считывание иРНК на рибосомах) с образованием белка вируса. Транскрипция осуществляется с помощью полимераз (транскриптаз) — ферментов вируса или клетки.

Биосинтез белков вируса различен у ДНК- и РНК-содержа- щих вирусов и проходит через следующие стадии:

• для ДНК-содержащих вирусов* ДНК вируса —» транскрип­ция иРНК -> трансляция белка вируса;

• для РНК содержащих минус-нитевых вирусов (минус-ге- номных): РНК вируса —> транскрипция иРНК —> транс­ляция белка вируса;

• для РНК-содержащих плюс-нитевых вирусов (плюс геном­ных): РНК вируса —> трансляция белка вируса;

• для РНК-содержащих ретровирусов: РНК вируса —> комп­лементарная ДНК -> транскрипция иРНК -» трансляция белка вируса.

Нуклеиновая кислота вируса кодирует синтез неструктурных и структурных белков. Неструктурные белки являются фермен­тами, обеспечивающими репродукцию вируса. Структурные белки входят в состав вириона: геномные (связанные с геномом ви­руса), капсидные и суперкапсидные белки.

Одновременно в клетке происходит и репликация (от лат. replicatio — повторение), т.е. синтез вирусных нуклеиновых кислот, являющихся копией исходных вирусных геномов. Способ реп­ликации генома зависит от способности вирусов индуцировать образование полимераз в клетке или от наличия полимераз в составе вириона

Формирование вирионов. Вирионы формируются путем само­сборки: составные части вириона транспортируются в места сборки вируса — участки ядра или цитоплазмы клетки. Соединение компонентов вириона обусловлено наличием гидрофобных, ионных, водородных связей и стерического соответствия. В ре­зультате самосборки капсомеров, образовавшихся из полипеп­тидов вируса, и взаимодействия их с нуклеиновыми кислотами вируса образуются нуклеокапсиды (нуклеопротеиды) просто устроенных вирусов.

Сложно устроенные вирусы содержат нуклеокапсид, или сердцевину, которые окружаются видоизмененными мембрана­ми клетки (суперкапсидом). Таким образом, сложноорганизо­ванный вирион включает в свой состав суперкапсидную обо­лочку, содержащую, кроме вирусспецифических белков, ком­поненты мембран клетки.

Выход вирионов из клетки. Процесс репродукции вирусов заканчивается высвобождением их из клетки. Это обязательный этап продуктивной вирусной инфекции, который реализуется двумя основными типами выхода вирионов из клетки. Первый тип — взрывной: из noi ибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов. По взрывному типу выходят из клетки просто устроенные вирусы, не имеющие суперкапсида. Второй тип — почкование (см. рис.3.7). Он присущ вирусам, имеющим суперкапсид — оболочку, которая является производ­ной от клеточных мембран. Сначала образовавшийся нуклеокап­сид или сердцевина транспортируется к клеточным мембранам, в которые уже встроены вирусспецифические белки. Затем начинается выпячивание этих участков. Сформировавшаяся поч­ка отделяется от клетки в виде сложно устроенного вируса. При этом клетка способна длительно сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство.

Полный цикл репродукции вирусов завершается через 5—6 ч (вирус гриппа и др.) или через несколько суток (вирус кори и др.).

Кроме описанного выше продуктивного типа взаимодействия, возможно взаимное сосуществование (вирогения) вируса и клетки в виде интегративного типа взаимодействия. Вирогения характе­ризуется интеграцией (встраиванием) нуклеиновой кислоты ви­руса в геном клетки, а также репликацией и функционирова­нием вирусного генома как составной части генома клетки.

Интегративный тип взаимодействия характерен для умерен­ных (см. раздел 3.3.3) ДНК-содержащих бактериофагов, онко- генных вирусов и некоторых инфекционных вирусов (вирусов гепатита В, аденовирусов, ВИЧ и др.). Для интеграции с ге­номом клетки необходимо возникновение кольцевой формы двунитевой ДНК вируса. Встроенная в состав хромосомы клет­ки ДНК вируса называется провирусом (ДНК-провирус). Про­вирус реплицируется в составе хромосомы и переходит в ге­ном дочерних клеток, т.е. состояние вирогении наследуется. Однако под влиянием некоторых физических или химических факторов провирус может исключаться из хромосомы клетки и переходить в автономное состояние с развитием продуктив­ного типа взаимодеиствия с клеткой. Дополнительная генети­ческая информация провируса при вирогении сообщает клетке новые свойства, что может быть причиной развития опухолей, аутоиммунных и хронических заболеваний. На способности вирусов к интеграции с геномом клетки основаны персистен- ция вирусов в организме и развитие персистентных вирусных инфекций.

3. Вирусы бактерий (бактериофаги)

Бактериофаги (от бактерии и греч. phagos — пожирающий, фаг) — вирусы бактерий, специфически проникающие в бактериальные клетки и поражающие их. В 1917 г. канадский микробиолог Ф. д’Эрелль обнаружил в фильтрате испражнений больного дизентерией литический агент, разрушающий возбудителя, названный им бактериофагом. Бактериофаги выявлены у боль­шинства бактерий, а также у других микроорганизмов, напри­мер у грибов.

Морфология и химический с о ста в. Строение бак­териофагов изучают с помощью электронной микроскопии образцов, контрастированных напылением металлов или фос- форно-вольфрамовои кислотой. Они имеют форму сперматозо­ида, кубическую (сферическую) или нитевидную форму, раз­мер их колеблется от 20 до 800 нм (у нитевидных форм).

Бактериофаги, имеющие форму сперматозоида, достигают длины до 200 нм и состоят из головки икосаэдрического типа, содержащей нуклеиновую кислоту, и хвостового отростка (рис.3.8). Капсид головки и чехол отростка состоят из полипептидных субъединиц, уложенных по кубическому (головка) или спи­ральному типу (отросток) симметрии. Хвостовой отросток имеет внутри полую трубку (стержень), сообщающийся с головкой, а снаружи — чехол отростка, заканчивающийся шестиугольной базальной пластинкой с шипами, от которых отходят фибриллы (нити).

Различают бактериофаги с длинным отростком, имеющие сокращающийся или не сокращающийся чехол, а также бакте­риофаги с короткими отростками, аналогами отростков, без от­ростков и нитевидные.

Бактериофаги содержат ДНК или РНК. Большинство из них содержат двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Имеются также однонитевые бактериофаги.

Кроме структурных белков, уложенных по спиральному или кубическому типу, у бактериофагов имеются внутренние бел­ки — геномные, связанные с нуклеиновой кислотой, а также ферменты (лизоцим, АТФаза).

Резистентность. Бактериофаги по сравнению с вирусами человека и бактериями более устойчивы к факторам окружаю­щей среды. Этиловый спирт, фенол и эфир не оказывают на них инактивирующего действия. К формалину и кислотам бак-ДНК

Рис. 3.8. Начальная стадия взаимодействия бактериофага с оболочкой бактерии.

териофаги высокочувствительны. Они длительно сохраняются при низкой температуре и высушивании. Большинство бактериофа­гов инактивируется при температуре 65—70° С.

Взаимодействие с бактериальной клеткой. По механизму взаимодействия с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные бактериофаги.

Вирулентные бактериофаги, попав в бактерию, реплициру­ются, формируя 200—300 фаговых частиц, и вызывают гибель (лизис) бактериальной клетки. Взаимодействие бактериофага с бактерией напоминает взаимодействие вирусов человека с клет­кой хозяина (см. раздел 3.2.2). Некоторые особенности имеют при этом бактериофаги с сокращающимся чехлом. Они адсор­бируются на клеточной стенке с помощью фибрилл хвостового отростка (см.рис.3.8). Чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помощью ферментов (лизоцима) как бы просвер

-ливает оболочку клетки. При этом нуклеиновая кислота из головки через канал трубки бактериофага инъецируется в клет­ку, а капсид бактериофага остается снаружи бактерии. Инъеци­рованная внутрь клетки нуклеиновая кислота подавляет биосин­тез компонентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеино­вую кислоту и белки бактериофага. Образовавшиеся в разных частях клетки компоненты бактериофага собираются в фаговые частицы путем заполнения фаговой нуклеиновой кислотой пустотелых капсидов головки. Затем в результате лизиса клетки бактериофаги выходят из нее. Весь цикл от адсорбции бакте­риофага на мембране клетки до его выхода из нее занимает 20— 40 мин.

По специфичности взаимодействия с клетками различают следующие бактериофаги: поливалентные, взаимодействующие с родственными видами бактерий; моновалентные, взаимодейству­ющие с бактериями одного вида; типовые, взаимодействующие с отдельными вариантами бактерий данного вида.

Умеренные бактериофаги после проникновения в бактерию не разрушают ее, так как ДНК фага встраивается в хромосому бактерий и передается по наследству. Это интегративный тип взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой. Встро­енная в хромосому бактерии ДНК бактериофага называется профагом, а бактерия — лизогенной. Такое сосуществование бактерии и умеренного бактериофага называется лизогенией.

Феномен лизогении широко распространен среди бактерий. Лизогенизация бактерий лежит в основе феномена лизогенной, или фаговой, конверсии, который заключается в приобретении лизогенными бактериями дополнительных свойств. Например, наличие профага в дифтерийной палочке обусловливает ее способность продуцировать экзотоксин. Под действием ультра­фиолетового и ионизирующего излучения, химических и других факторов профаг может превращаться в вирулентную форму, что сопровождается репликацией бактериофагов и лизисом бак­терий.

Бактериофаги применяют в лабораторной диагностике для идентификации бактерий с целью выявления источника ин­фекции (эпидемиологическое маркирование). Для этого исполь­зуют фаготипирование: на чашку с питательной средой, засе­янной чистой культурой возбудителя, наносят капли суспензий различных диагностических бактериофагов. При наличии чув­ствительности возбудителя к фагу на месте нанесенной капли суспензии бактериофага образуется стерильное пятно (бляшка) вследствие лизиса бактерий.

Кроме диагностических бактериофагов, имеются лечебно­профилактические, применяемые для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых некоторыми бактериями.