.Частина VI протозойні інфекції

Підцарство найпростіших (Protozoa) - досить численна й дуже різноманітна група еукаріотичних одноклітинних мікроорганізмів. Тепер виділяють 4 класи найпростіших: джгутикові (Zoomastigophora), саркодові (Rhisopoda), споровики (Sporozoa) і війкові (Infusoria). У людей вони викликають амебіаз, малярію, ток­соплазмоз, балантідіаз, лямбліоз, трипаносомоз, криптоспоридіоз, саркоспоридіоз, ізоспороз і трихомоноз. Паразитарні інфекції через масове розповсюдження скла­дають сьогодні проблему глобального значення. Вони завдають великої шкоди здоров'ю людей і наносять значні економічні збитки в багатьох країнах світу.

Розділ 17

Методи лабораторної діагностики

Лабораторні методи діагностики захворювань включають мікроскопічні, куль- туральні, серологічні, алергічні й біологічні дослідження.

Матеріалом для дослідження може бути кров, харкотиння, випорожнення, сеча, вагінальний вміст, пунктати абсцесів, лімфовузлів і кісткового мозку, зскрібки з інфільтратів шкіри, шматочки тканин, взятих при біопсії й аутопсії тощо.

Мікроскопічний метод. Дослідження під мікроскопом направлено на вияв­лення збудників у нативних і забарвлених препаратах. Окрім того, їх можна знай­ти в гістологічних зрізах, виготовлених з уражених тканин. Для забарвлення най­простіших найчастіше використовують метод Романовського-Гімзи.

При лабораторній діагностиці малярії, трипаносомозу і токсоплазмозу досліджу­ють звичайні мазки крові й товсту краплю, яку виготовляють кількома способами:

1. Знежиреним предметним склом торкаються краплі крові, що виступає після проколу м' якоті пальця, і, не відриваючи від неї скла, круговими рухами доводять діаметр до 1-1,5 см.

2. На одному предметному склі готують комбінований препарат - звичайний тонкий мазок і на деякій відстані від нього товсту краплю.

3. На звичайний, ще вологий мазок наносять краплю крові, яка розтікаючись, утворює правильний диск, розмір якого визначає величина краплі, але товщина практично не змінюється. В ній збудники і клітини крові розподіляються рівно­мірніше, ніж у звичайній товстій краплі (рис. 107).

Звичайні тонкі мазки крові фіксують метанолом (3 хв), етанолом (10-15 хв) або в суміші Никифорова (20 хв). Товсті краплі, незалежно від способу виготов­

лення, висушують поступово і не фіксують. Мазки за­барвлюють 40-45 хв фарбою Романовського (1 крапля робочого розчину фарби на 1 мл нейтральної (рН 7,0) води, а товсту краплю - 4-5 % водним розчином фарби протягом 20-25 хв. Препарати ретельно промивають водою, висушують у вертикальному положені й мікрос­копують під імерсійним об'єктивом.

Мазки з ліквора і пунктатів готують так само, як і мазки крові, фіксують і забарвлюють за методом Рома- новського-Гімзи.

Зскрібки з інфільтратів шкіри роблять так: ураже­ну ділянку протирають спиртом, стискають між двома пальцями і гострим скальпелем роблять поверхневий надріз шкіри. Тим же скальпелем роблять зскрібок із дна і країв надрізу, швидко наносять тонким шаром на предметне скло, фіксують у суміші Никифорова й за­барвлюють за Романовським-Гімзою. Забарвлення залізним гематоксиліном за Гейденгайом використовують для виявлення тонкої структури ядра і цитоплазми найпростіших.

Мазки із вагінального вмісту роблять при підозрі на трихомоноз. Нанесену на предметне скло краплю матеріалу накривають покрівним скельцем і відразу мікро­скопують. У такій надавленій краплі виявляють рухливі форми найпростіших. Ви­сушені та фіксовані мазки забарвлюють за методом Грама або Романовського-Гімзи. Останній має переваги, оскільки дає змогу легко ідентифікувати трихомонади.

Для виявлення найпростіших у кишечному тракті готують мазки із дуоденаль­ного вмісту і випорожнень. При дуоденальному зондуванні беруть всі три порції (А, В, С) так, щоб не було домішки шлункового соку. Отримані порції окремо вилива­ють у чашки Петрі, відбирають слизові грудочки і готують препарат надавленої краплі. Порції жовчі центрифугують, з осаду роблять мазки, які досліджують спо­чатку під малим, а потім під великим збільшенням. У дуоденальному вмісті можна виявити вегетативні форми лямблій. Рекомендують проглядати 10-20 препаратів на­давленої краплі.

Нативні препарати з фекалій готують так: на предметне скло наносять краплю ізотонічного розчину хлориду натрію і поряд таку ж кількість розчину Люголя. Де­рев'яною або скляною паличкою беруть частинку випорожнень і розтирають окре­мо в обох краплях, які потім накривають покрівними скельцями і розглядають при малому і великому збільшенні мікроскопа. Дуже добрі результати отримують при дослідженні живих найпростіших під фазово-контрастним або аноптральним мікро­скопом.

Рис. 107. Різні способи виготовлення товстої краплі.

Якщо неможливо негайно дослідити випороження, їх консервують і направ­ляють до лабораторії. Для цього використовують консерванти Барроу або Сафар- лієва, налиті у пеніцилінові флакони приблизно до половини. До них додають свіжі фекалії в об'ємі, що складає третину консерванта. При цьому морфологічні

ознаки вегетативних форм і цист найпростіших зберігаються протягом 30 і більше днів. Перед дослідженням консервований матеріал не перемішують, а з придон­ного осаду краплю переносять піпеткою на предметне скло і ретельно розтира­ють дерев'яною паличкою до отримання гомогенної емульсії. При використанні консерванта Барроу до матеріалу добавляють краплю розведеного барвника (три- панований або метиленовий синій, янусовий зелений, нейтральний червоний).

При малій кількості цист найпростіших у досліджуваному матеріалі викори­стовують методи збагачення. Вони базуються на спливанні цист у розчинах із ви­сокою щільністю (флотація у сульфаті міді чи цинку) або осіданні їх у рідині з низькою щільністю (формалін-ефірна седиментація).

Виділення чистих культур при діагностиці протозоозів використовують значно рідше, ніж мікроскопічні дослідження. Культивування найпростіших про­водять лише у спеціалізованих лабораторіях, інститутах, наукових центрах. Виді­ляти чисті культури найпростіших у звичайних мікробіологічних лабораторіях не рекомендують. У відповідних центрах на спеціальних середовищах, курячих емб­ріонах або культурах клітин можна виділяти практично всі види патогенних най­простіших. До живильних середовищ потрібно добавляти кров, сироватку, яєч­ний білок, вуглеводи, амінокислоти, вітаміни. Переважну більшість найпрості­ших культивують при 37 °С, але лейшманії й трипаносоми краще ростуть при температурі 20-25 °С. Для виявлення останніх сіють кров хворих, пунктати лімфа­тичних вузлів і кісткового мозку, ліквор, зскрібки з горбків або інфільтратів чи виразок. Види найпростіших, які уражають кишечний тракт (амеби, лямблії, ба- лантидії, кишкові трихомонади) значно легше виявити за допомогою мікроскопії, ніж культуральним методом.

Для швидкої діагностики деяких протозойних інфекцій (малярія, трипаносо­моз та ін.) розроблено новий метод виявлення найпростіших - ДНК-зонди з різни­ми мітками. Метод дуже чутливий і високоспецифічний. Він грунтується на вияв­ленні в лізованій крові характерних для збудників фрагментів ДНК.

Серологічна діагностика. Антитіла в діагностичних титрах (спочатку IgM, пізніше IgG) появляються в сироватці крові на другому-четвертому тижні хворо­би. При різних видах протозоозів використовують реакції аглютинації (особливо латекс-аглютинації), преципітації в гелі, зв'язування комплементу, прямої й не­прямої імунофлуоресценції, імуноелектрофорезу, непрямої гемаглютинації та іму- ноферментний аналіз. Частіше серологічні реакції ставлять при підозрі на амебіаз, лейшманіоз, трипаносомоз і токсоплазмоз. Однак всі вони мають лише допоміж­не діагностичне значення. Набагато ширше серологічні дослідження використо­вують при вивченні динаміки інфекційного процесу, ефективності проведеного лікування і особливо для виявлення інфікованості донорів з метою попередження посттрансфузійної малярії, американського трипаносомозу тощо.

Методика постановки серологічних реакцій при протозоозах така сама, як і при інших інфекційних хворобах. Для виявлення та ідентифікації антитіл викори­стовують антигенні діагностикуми, а для визначення антигенів - еритроцитарні антитільні діагностикуми.

Біологічний метод з діагностичною метою вживають порівняно рідко. Зара­ження лабораторних тварин (гвінейських свинок, кошенят, цуценят, хом'ячків, білих мишей) здебільшого проводять з метою вивчення наукових проблем, зокре­ма патогенності найпростіших, вірулентності окремих штамів, виявлення патоло- гоанатомічних змін, лікарської ефективності різних препаратів тощо.

Найпростіший метод зараження лабораторних тварин - згодовування їх досліджуваним матеріалом, який добавляють до корму. Значно рідше цей матері­ал вводять парентерально або через зонд у шлунок чи сліпу кишку при лапаро­томії та ін. Впродовж 30 днів у тварин мікроскопічно досліджують кров, мазки- відбитки з паренхіматозних органів або гістологічні зрізи з уражених тканин. Останнім часом почали також використовувати зараження курячих ембріонів при діагностиці лейшманіозів і токсоплазмозів та тканинних культур при багатьох протозоозах.

Алергічні проби для діагностики протозойних інфекцій найчастіше викорис­товують при лейшманіозах із лейшманіном та при токсоплазмозі з токсоплазмі- ном. Методика постановки цих проб така сама, як і з іншими алергенами.

Розділ 18

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ОКРЕМИХ ПРОТОЗООЗІВ

Протозойні захворювання людини можуть викликати біля 50 видів патоген­них найпростіших. На території України зустрічається 10 нозоологічних форм, що спричиняються цими своєрідними мікроорганізмами. Розглянемо методи ла­бораторної діагностики найголовніших протозоозів.