Респіраторний хламідіоз

Хламідійна пневмонія - інфекційна хвороба, яка характеризується запален­ням легень, катаром верхніх дихальних шляхів, загальною інтоксикацією. Збуд - ник - Chlamydia pneumoniae. Від інших хламідій вона відрізняється грушоподіб­ною формою елементарних тілець. Джерело інфекції - хворі люди. Збудник виді­ляється з носоглотки, механізм зараження - повітряно-крапельний.

У зв'язку з тим, що C. pneumoniae погано розмножується в курячих ембріо­нах і культурах клітин, методи бактеріологічної діагностики не використовують­ся. Практичні лабораторії не мають реагентів і для серологічної діагностики респіраторного хламідіозу. Для виявлення та ідентифікації хламідій пневмонії в досліджуваному матеріалі використовують лише реакцію імунофлуоресценції із застосуванням моноклональних антитіл до високоспецифічного антигена збудника.

Сечостатевий хламідіоз

Патогенні хламідії, особливо C. trachomatis, досить часто викликають гострі або хронічні запалення уретри, вагіни, шийки матки. Урогенітальний хламідіоз впродовж останнього десятиріччя зустрічається частіше, ніж сифіліс і гонорея. Основний шлях передачі захворювань - статевий, значно рідше - побутовий.

Матеріалом для лабораторного дослідження служать зскрібки зі слизової уретри у чоловіків і жінок та зскрібки із шийки матки у жінок. Український НДІ дерматології та венерології розробив уніфіковані методи діагностики сечостате­вих хламідіозів. Серед них важливе значення мають експрес-методи, виявлення морфологічних структур та антигенів хламідій у досліджуваному матеріалі, виді­лення хламідій в культурах клітин, виявлення хламідійних антитіл за допомогою серологічних реакцій та полімеразна ланцюгова реакція.

Експрес-методи. Ряд фірм США та Франції розробили спеціальні діагнос­тичні тести для проведення імунохроматографічних експрес-методів, які можуть видати результат через 10-30 хв. Однак їх чутливість і специфічність значно мен­ша, ніж при проведенні повномасштабних досліджень.

Мікроскопічні методи. Досліджуваний матеріал беруть у хворих, які протягом місяця не повинні приймати антибіотики. Зскрібки роблять одноразо­вим зондом (щіточкою, ложечкою Фолькмана, жолобкуватим зондом). Інфекцій­ний матеріал наносять на поверхню 8 мм ямки спеціального предметного скла. Мазок висушують 20-30 хв і фіксують у холодному ацетоні протягом 5-10 хв, за­барвлюють за методом Романовського-Гімзи 35-40 хв, обробляють підкисленим етанолом (3-5 крапель льодяної оцтової кислоти на 15-20 мл спирту) протягом 5­10 с, промивають водою, висушують і мікроскопують. Ретикулярні тільця забарв­люються в синьо-фіолетовий колір, а елементарні тільця - в рожево-червоний. Зернисті структури хламідій розміщуються поблизу ядра. Виявлення 5-10 типо­вих включень має діагностичне значення.

Антигени хламідій в інфекційному матеріалі виявляють за допомогою пря­мої і непрямої реакції імунофлуоресценції. Суть прямого методу полягає у з'єднанні мічених флуорохромом антитіл із хламідійним антигеном і виявленні специфіч­ного світіння при люмінесцентній мікроскопії. Люмінесцентна антихламідійна сироватка виготовляється в Харкові. Є багато закордонних діагностичних систем для проведення цього методу.

Суть непрямого методу полягає у з'єднанні комплексу антиген + немічені хламідійні антитіла з видовою (антиглобуліновою) міченою флуоресцеїном сиро­ваткою.

Окрім мікроскопічних методів, антигени хламідій в інфекційному матеріалі можна виявити за допомогою імуноферментного аналізу. Принцип методу поля­гає у взаємодії моноклональних хламідійних антитіл, адсорбованих на твердій фазі, з антигеном хламідій, що знаходиться у досліджуваному матеріалі, й утво­ренні імунних комплексів. Матеріалом для аналізу можуть бути зскрібки зі слизо­вих оболонок, центрифугати сечі, секрети, біоптати тощо

.Вже розроблено й впроваджено в практику багато діагностичних тест-сис­тем для ІФА. Досліджуваний матеріал вносять на адсорбовані в лунках планшети антитіла. Оцінка результатів проводиться за допомогою імуноферментного аналі­затора згідно з інструкцією до кожної тест-системи. Чутливість ІФА для виявлен­ня хламідій коливається в межах 50-70 % у чоловіків і 88-100 % у жінок.

Виділення хламідій в культурах клітин. Найбільш точним і доказовим ме­тодом діагностики хламідіозу є виділення збудника на культурі клітин (золотий стандарт). Найчастіше використовують культури клітин L-929, МсС oy, Hela, BHK-21. У стерильні плоскодонні пробірки діаметром 14 мм вносять на дно покрівні скельця, додають по 1 мл клітинної суспензії в живильному середовищі (1-10⁵ клітин/мл) і ставлять на 24-48 год у термостат при 37 °С для утворення моношару клітин на покрівних скельцях. Потім середовище виливають, вносять інфекційний матеріал, оброблений антибіотиками, центрифугований протягом години при 3000 об/хв, інкубують у термостаті 2 год при 37 °С. Досліджуваний матеріал виливають, замінюють його свіжим живильним середовищем, інкубу- ють у термостаті 48-72 год. Покрівні скельця з моношаром клітин виймають, фіксу­ють 10 хв метанолом, промивають фосфатним буфером і забарвлюють за методом Романовського-Гімзи. Покрівні скельця монтують на предметному склі моноша­ром клітин донизу в канадському бальзамі.

Під імерсійним об'єктивом виявляють наявність цитоплазматичних включень. Елементарні тільця хламідій забарвлюються у червоний, а ретикулярні тільця - у синій колір.

При обробці препаратів флуоресцентними антитілами моношар клітин також монтують на предметному склі в гліцерині й досліджують за допомогою люмінес­центного мікроскопа. Метод високо специфічний (100 %) і чутливий (75 %), але досить складний, дорогий, результат отримують через 72-96 год. Окрім того, є вели­кий ризик зараження персоналу. Для практичних лабораторій він ще малодоступний.

Імунологічна діагностика. У сучасній практиці серологічних досліджень сечостатевих хламідіозів використовують 4 імунологічні реакції: непрямої іму- нофлуоресценції, непрямої гемаглютинації, зв'язування комплементу та метод імуноферментного аналізу. Матеріалом для дослідження в усіх 4-ох реакціях є сироватка крові хворих, секрети статевих залоз.

З метою виявлення хламідійних антитіл у реакції непрямої імунофлуорес­ценції застосовують специфічний хламідійний антиген, який забезпечує реакції з антитілами до всіх варіантів C. trachomatis.

При постановці цієї реакції на предметному склі готують слайд-антигени. Скло вміщують на трафарет із зазначенням зон нанесення антигенів (контрольно­го і специфічного). Слайди висушують 15-20 хв і фіксують в охолодженому аце­тоні. Потім на слайд-антигени наносять відповідні розведення сироватки, інку- бують 40 хв при 37 °С у вологій камері. Після цього препарат тричі промивають фосфатним буферним розчином, додають антивидову люмінуючу сироватку, ще раз витримують 40 хв у вологій камері й знову тричі промивають. Висушені слайди досліджують під люмінесцентним мікроскопом. Техніку постановки ре­акції виконують згідно з інструкцією, що додається до кожної діагностичної тест- системи.

Оцінку результатів проводять за ступенем специфічної флуоресценції комп - лексів елементарних і ретикулярних тілець з антитілами, використовуючи кла­сичну чотириплюсову систему. Титром хламідійних антитіл сироватки хворого вважають те найбільше її розведення, при якому спостерігається чітке яскраво- зелене світіння не менше, ніж на 2+. При хламідійному ураженні сечостатевої системи він дорівнює 1:64 і вище. Постановка РІФ методом парних сироваток повинна виявити наростання титру антитіл у 4 рази від початкового рівня.

Рекцію непрямої гемаглютинації використовують, в основному, для діагности­ки зоонозних хламідіозів і первинного серологічного скринінгу захворювань у людей.

Реакція зв'язування комплементу дає змогу виявити антитіла до родоспеци- фічного антигену хламідій. Ставлять її за звичайною схемою. Діагноз вважають позитивним при титрі комплементзв'язуючих антитіл 1:64 і вище. РЗК мало підхо­дить для діагностики хламідійних інфекцій генітальної системи.

Виявлення хламідійних антитіл імуноферментним методом базується на взає­модії антигену з хламідій на поверхні лунок полістирилових планшет з IgM і IgG у сироватках хворих людей. Уже виготовлена велика кількість діагностичних наборів.

Спочатку сироватку хворого розводять у допоміжному ряді пробірок, потім проводять сорбцію антитіл у лунках мікротитрувального планшета. Детальна ме­тодика постановки ІФА викладена в інструкції, що додається до діагностичної тест-системи. ІФА рекомендують ставити за допомогою парних сироваток. Оцін­ку результатів здійснюють за допомогою імуноферментного аналізатора за вели­чиною оптичної щільності розчинів у лунках полістирилового планшета.

Мікоплазмози

Мікоплазмози - інфекційні захворювання людини, які викликають різні види мікоплазм, представники родів Mycoplasma і Ureaplasma з родини Mycoplasma- taceae. Розрізняють респіраторний мікоплазмоз (пневмонія, фарингіт, трахеоброн­хіт, бронхіт), урогенітальний мікоплазмоз (уретрит, цистит, простатит, пієлонеф­рит; у жінок - вагініт, кольпіт, цервіцит, ендометрит) і ураження суглобів (арт­рит). Більшість мікоплазмозів мають глобальне розповсюдження й переважно хронічний перебіг. У окремих випадках мікоплазми причетні до виникнення ендо­кардитів, патології вагітності й ураження плода.

Респіраторний мікоплазмоз найчастіше викликає Mycoplasma pneumoniae, значно рідше M. hominis. Матеріалом для виділення збудника служить харкотин­ня, слиз із носоглотки, плевральний ексудат, біоптати легеневої тканини, лаваж (змиви з поверхні бронхіол і альвеол, отримані при бронхоскопії); для серологіч­ної діагностики беруть кров.

Досліджуваний матеріал можна зберігати при температурі 4 °С у середовищі нагромадження (триптиказний соєвий бульйон з бичачою сироваткою). Посіви роблять на щільні середовища (наприклад, серцево-мозковий агар), що містять всі компоненти, необхідні для росту мікоплазм, та на двофазне середовище (корот­кий стовпчик селективного агару з налитим поверх нього сироватко-глюкозним бульйоном). Виділити збудника найчастіше вдається саме на двофазному середо­вищі. Для пригнічення росту супутньої мікрофлори до середовищ попередньо добавляють пеніцилін і ацетат талію, до яких мікоплазми пневмонії стійкі.

Ознаки росту (ферментація глюкози і зміна кольору рідкої частини двофаз­ного середовища та ріст дуже дрібних колоній на щільному агарі) появляються у строки від одного до семи тижнів. Колонії мікоплазм діаметром 0,1-0,2 мм мають щільний зернистий центр, який вростає в агар, та розпливчасту прозору перифе­ричну зону (у вигляді "випускної яєшні") (див. вкл., рис. 26).

Довготривалість росту мікоплазм на щільних середовищах обумовила роз­робку швидкого методу їх ідентифікації на чашках без додаткових пересівів для виділення чистих культур. Найпоширенішим методом ідентифікації колоній є тест епіфлуоресценції. Він полягає в тім, що на поверхню колонії наносять люмінуючі мікоплазменні антитіла й виявляють специфічне їх світіння при мікроскопії в уль­трафіолетових променях.

Розроблено також метод вирощування мікоплазм пневмонії в органній куль­турі трахеї курчат, який дає позитивні результати вже через 3-5 днів.

Остаточну ідентифікацію культур проводять на основі морфологічних, куль- туральних властивостей та деяких інших ознак (табл. 67).

Таблиця 67

Диференціальні ознаки патогенних для людини мікоплазм

Вид		Виділення ферментів				Ферментація		Відношення до еритро­міцину
		уреази		аргінази	фосфа­тази	глюкози			манози
M. pneumoniae	-		-	-	+		+	чутливі
M. hominis	-		+	-	-		-	стійкі
M. arthritidis	-		+	+	-		-	?
M. fermentans	-		+	-	+		-	стійкі
U. urealyticum	+		-	+	-		-	чутливі

Значно швидше можна виявити мікоплазми пневмонії або їх антигени в дослі­джуваному матеріалі за допомогою реакцій імунофлуоресценції, непрямої гема­глютинації, агрегат-аглютинації та ІФА. Однак, широке їх використання обмежене відсутністю або недостатньою кількістю відповідних діагностичних тест-систем.

Дуже ефективним методом діагностики респіраторного мікоплазмозу є ме­тод гібридизації ДНК за допомогою спеціальних зондів, які є природними плазмі- дами мікоплазм або штучно синтезованими олігонуклеотидами.

Одним із перспективних і найчутливіших методів діагностики мікоплазмозів є полімеразна ланцюгова реакція. Для виявленняM. pneumoniae розроблена і впро­ваджена тест-система, яка дозволяє виявити поодинокі мікоплазми, які іншими способами виділити неможливо.

У практичних лабораторіях діагностику респіраторного мікоплазмозу найча­стіше проводять на основі результатів серологічних досліджень. Найбільш широ- ко використовують реакції зв'язування комплементу, непрямої гемаглютинації, непрямої імунофлуоресценції та метод ІФА з використанням гліколіпідних анти­генів M. pneumoniae зарубіжних фірм.

Серед усіх серологічних методів найбільш стандартизована постановка РЗК. Високі титри комплементзв'язуючих антитіл виявляють впродовж 3-7-го тижнів після видужування. Підвищення титру антитіл за допомогою РНГА виявляють раніше, ніж в РЗК. Ще чутливішим методом є діагностика за допомогою імуно- ферментного аналізу з використанням стандартного антигену, адсорбованого в лунках мікротитраційних полістирилових планшет. Діагностичним титром сиро­ватки вважають 1:64.

Мікоплазменний артрит найчастіше викликає M. arthritidis, рідше M.fer- mentans, M. pneumoniae, і U. urealyticum. Джерелом збудників, що уражають су­глоби, є хворі люди або безсимптомні носії мікоплазм. Матеріалом для лабора­торних досліджень є синовіальна рідина, кров, тканини суглобових хрящів.

Мікробіологічна діагностика зводиться до посіву досліджуваних матеріалів на щільні і двофазові середовища, виділення та ідентифікації чистих культур (табл. 67). Збудники або антигени можна виявити в клінічному матеріалі за допо­могою тих же методів, що використовуються для діагностики респіраторних міко- плазмозів.

При проведенні серологічних досліджень найчастіше вживають реакції зв'я­зування комплементу, агрегат-аглютинації та імуноферментний аналіз.

Уреаплазмози - гострі або хронічні запальні процеси сечостатевих органів, викликані Ureaplasma urealyticum. Ці захворювання значно рідше може спричи­няти іM. hominis. Під час вагітності уреаплазменна інфекція активізується й може стати причиною передчасних пологів та спонтанних абортів, а при внутрішньоут- робному зараженні може викликати загибель плода. У зв'язку з неможливістю відрізнити за клінічною картиною уреаплазмоз від торпідної чи хронічної гонореї особливого значення набуває етіологічна діагностика, тобто виділення збудника.

Лабораторні дослідження мають вирішальне значення в розпізнаванні уроге- нітальних запальних процесів, тим більше, що серед людей досить часто зустрі­чається безсимптомне носійство мікоплазм і уреаплазм. Найчастіше використову­ють бактеріологічний та серологічний методи діагностики, а також мікроскопіч­не виявлення уреаплазм у препаратах сперми. Переваги надають культуральним методам.

Дуже важливо правильно взяти досліджуваний матеріал. У чоловіків його беруть з уретри не раніше як за 4-6 год до сечовипускання. Зовнішній отвір урет­ри ретельно очищають ватним тампоном, змоченим стерильною дистильованою водою. Перші краплини вільно витікаючих виділень при надавленні на уретру відкидають, а наступні використовують для посівів на рідкі та щільні середови­ща. При відсутності або незначних виділеннях проводять масаж уретри, а потім роблять зскрібок зі слизової оболонки ложечкою Фолькмана чи жолобкуватим зондом на глибині 2-3 см. Для посіву можна також використовувати секрет про­стати, сперму, осад із 10 мл першої ранкової порції сечі після її центрифугування.

У жінок матеріал для посіву беруть із уретри, каналу шийки матки і заднього склепіння вагіни перед чи відразу після менструацій.

Для культивування уреаплазм використовують стандартні рідкі й щільні сере­довища, що виробляють в Українському НДІ дерматології та венерології (м. Хар­ків). Посіви проводять відповідно до інструкції, що додаються до середовищ.

Пробірки і чашки з посівами вміщують у термостат не пізніше 30-60 хв після взяття і посіву клінічного матеріалу. Облік результатів посівів у рідке середовище проводять через 24-48 год. Посіви на щільне середовище інкубують при 37 °С в атмосфері підвищеного вмісту СО₂ протягом 5 діб, проводячи щоденний контроль за ростом колоній.

При посіві в рідке середовище уреаплазми змінюють його колір від початко­вого жовтого до рожевого при відсутності каламуті. Сумнівним вважають резуль­тат при зміні кольору середовища та наявності каламуті. Якщо колір середовища не змінився, результат оцінюють як негативний. На щільному середовищі уреап- лазми утворюють характерні дуже дрібні колонії (0,1-0,2 мм) округлої форми із зубчастим краєм і зморщеною поверхнею. Їх досліджують під мікроскопом при малому збільшенні з використанням об'єктива 40х.

Ідентифікацію виділених культур проводять на основі їх морфології, харак­теру росту та інших ознак. Від інших видів мікоплазм V. игєаїуИсит відрізняється здатністю гідролізувати сечовину, оскільки вона єдина продукує уреазу. Отже, метод визначення уреазної активності є основним при діагностиці уреаплазмозу.

Мікроскопічне визначення уреаплазм у препаратах сперми базується на ви­явленні ДНК збудника при забарвленні флуорохромом олівоміцином. Для цього використовують тест-систему, що виробляється в Українському НДІ дерматології та венерології.

Краплю сперми наносять на предметне скло, розподіляють її до розмірів по- крівного скельця, висушують і фіксують протягом 3 хв у холодному 70° спирті. На мазок наносять робочий розчин олівоміцину на 30 хв, промивають дистильова­ною водою, додають краплю забуференого гліцерину і накривають покрівним скельцем. При мікроскопії під люмінесцентним мікроскопом уреплазми мають вигляд яскраво-зеленої зернистості на темному фоні препарату. Інші види бак­терій також яскраво світяться, але вони легко відрізняються від уреаплазм за роз­мірами і формою. Інтенсивність зараження сперми уреаплазмами оцінюють за чотириплюсовою системою: 4+ - максимальна кількість уреаплазм у вигляді скуп­чень на більшості сперматозоїдів; 3+ - окремі уреаплазми і їх скупчення у двох- трьох полях зору; 2+ - невеликі скупчення уреаплазм на окремих сперматозоїдах; 1+ - поодинокі уреаплазми в препараті.

Для серологічної діагностики можна використати постановку реакцій зв'я­зування комплементу, непрямої імунофлуоресценції, непрямої гемаглютинації, агрегат-аглютинації та метод імуноферментного аналізу. Однак реактиви для цих реакцій поки що мало доступні для практичних лабораторій і є лише у профільних науково-дослідних центрах.Частина IV ВІРУСОЛОГІЯ

Розділ 12