За 5-6 дней до занятии два дня подряд кролику или крысе подкожно вводят раствор соля­нокислого фенил гид ратина из расчета 30 мг на 1 кг массы, который является гемолитическим ядом. У Животного развивается гемолитическая анемия.

У опытного и контрольного кроликов (или крыс) определяют число эритроцитов, содержа­ние гемоглобина, цветной показатель, количество ретикулоцитов, показатель гематокрита, ос­мотическую резистентность эритроцитов. У кроликов забор крови производят из краевой вены уха, у крыс из сердца или яремной вены под наркозом.

Для определения количества эритроцитов кровь берут в смеситель до метки «0,5», кончик вы­тирают, набирают физиологический раствор до метки «101», (разведение крови в 200 раз), затем смеситель интенсивно встряхивают в течение 10-20 сек.

Подготавливают счетную камеру Горяева, для этого покровное стекло притирают до появ­ления радужных колец. Выпустив из смесителя 1-2 капли, вносят в камеру каплю разведенной крови. Под микроскопом при малом увеличении (об. X 8) и слегка опушенном конденсоре на­ходят сетку, переводят на большое увеличение (об. X 40) и подсчитывают число эритроцитов в 5 больших т.е. 80 малых квадратах. Полученный результат, умноженный на 10000, составляет число эритроцитов в 1 мкл.

Для определения гемоглобина в пробирку гемометра Сали наливают 0,1 N НС1 до нижней метки. Затем набирают кровь в капиллярную пипетку до метки «20», что соответствует 20 мкл, вытирают кончик, погрузив его в раствор соляной кислоты, осторожно выпускают кровь на дно пробирки. Пипетку 2-3 раза промывают тем же раствором. Смесь оставляют стоять 2-3 мин.; образующийся солянокислый гематин имеет коричнево-желтую окраску. Затем в пробирку по каплям добавляют дистиллированную воду, периодически помешивая стеклянной палочкой, до выравнивания интенсивности окраски смеси с окраской стандартных растворов в боковых пробирках. Определяют концентрацию гемоглобина в г % и процентах по Сали. 100% по Сали соответствует 16,67 г% гемоглобина..

Расчет цветного показателя производят по формуле:

Содержание гемоглобина (в процентах по Сали) / удвоенные две цифры числа эритроцитов

(в мкл)

Для изучения мазка крови его высушивают на воздухе, фиксируют в смеси спирта и эфира в течение 3 мин, красят по Романовскому 20-25 мин, промывают водой, просушивают филь­тровальной бумагой. Препарат рассматривают с иммерсионной системой (об. X 90), обрашая внимание на форму, размеры эритроцитов, появление регенераторных форм (нормобласты, по-лихроматофильные эритроциты).

Для подсчета ретикулоцитов на предметном стекле с заранее нанесенной и высушенной крас­кой бриллианткрезилблау делают мазок крови и препарат тотчас же помещают во влажную ка­меру на S-6 мин. Затем мазок высушивают на воздухе. При этом эритроциты окрашиваются в зеленоватый цвет, в ретикулоцитах выявляется сетчато-нитчатая субстанция. Под микроскопом с иммерсионной системой, при ограничении поля зрения (в окуляр вкладывают бумажный диск с небольшим окошком) осторожно передвигая мазок, сосчитывают 1000 клеток и определяют количество приходящихся на них ретикулоцитов (в процентах).

Для определения гематокрита кровь смешивают с антикоагулянтом (2 мг щавелевокислого ка­лия на 1 мл крови). Специальный градуированный капилляр заполняют исследуемой кровью, помешают в рамки, которые укрепляют на центрифуге и включают ее на 10 мин при 8000 об/ мин. После окончания центрифугирования определяют высоту столбика эритроцитарной мас­сы, выражают ее в процентах по отношению к длине капилляра, которая принимается за 100%. Показатель гематокрита характеризует соотношение эритроцитарной массы и плазмы крови.

Для определения осмотической резистентности эритроцитов у опытного и контрольного жи­вотных берут по 1,5 мл крови и помещают в пробирку, содержащую 2-3 капли гепарина. Подго­тавливают 2 штатива с 6 центрифужными пробирками, содержащими по 5 мл раствора хлорида натрия различной концентрации: 1-0,85%: 2-0,50%: 3-0,45%: 4-0,40%: 5-0,35%: 6-0,30%. Затем с помощью пипетки от гемометра Сали в каждую пробирку вносят по 0,2 мл исследуемой крови. Осторожным встряхиванием пробирки достигают равномерной взвеси. Через 30 минут содер­жимое пробирок центрифугируют при 2000 об/мин течение 5 минут. Определяют минимальную резистентность эритроцитов по пробирке с самой высокой концентрацией хлорида натрия, в

которой отмечается гемолиз. Максимальную резистентность определяют по пробирке с самой низкой концентрацией хлорида натрия, в которой нет осадка и произошел полный гемолиз. В

норме минимальная резистентность 0,48-0,46%, максимальная резистентность 0,34-0,32%.

Отмечают изменение основных гематологических показателей при фенилгидразиновой ге­молитической анемии.

Опыт 2. Сосудистый механизм компенсации при острой постгеморрагической анемии

Лягушку обездвиживают подкожным введением 0,5 мл 0,1 % раствора диплацина (или лиете-

нона), фиксируют на дощечке.

Над прямоугольным отверстием осторожно растягивают язык, укрепляя его булавками, и под

малым увеличением микроскопа (об. X 8) наблюдают кровоток. Выбирают участок сосудистой сети с интенсивным кровотоком в артериоле и капиллярах, подсчитывают количество функци­онирующих капилляров в поле зрения и с помощью специальной сетки, вставленной в окуляр, измеряют диаметр артсриолы (в относительных единицах). Язык периодически следует смачи­вать физиологическим раствором. Затем на задней поверхности бедра делают разрез, выделяют бедренную артерию и перерезают ее, выпуская 0,5-0,7 мл крови (у лягушки массой 30 г). После острой кровопотери наблюдают изменение кровообращения языка: уменьшение числа функци­онирующих капилляров и диаметра артериального сосуда вследствие спазма. Затем в спинной лимфатический мешок вводят 2-2,5 мл раствора Рингера и в течение 10-15 мин. наблюдают пос­тепенную нормализацию кровотока в сосудах языка.

Зарисовывают картину сосудистой сети языка в 1 и 11 фазы развития острой постегеморраги-ческой анемии, делают выводы.

Занятие 3. ЛЕЙКОЦИТОЗЫ И ЛЕЙКОПЕНИИ

Цель занятия: моделирование и изучение лейкоцитоза и лейкопении: изучение мазков периферической крови стоматологических больных с воспалительными процессами челюстно-лицевой области

Изменения в системе белой крови проявляются в виде лейкоцитозов, лейкопений и лейкозов.

Лейкоцитоз и лейкопения развиваются как реакции системы белой крови при разнообраз­ных заболеваниях; лейкоцитоз возникает и при некоторых физиологических состояниях.

В механизме возникновения лейкоцитозов основная роль принадлежит стимуляции лейко-поэза и ускоренному выходу лейкоцитов в кровь - реактивный лейкоцитоз (абсолютный); воз­можно развитие перераспределительного лейкоцитоза (относительный).

Лейкоцитозы обычно классифицируют в зависимости от того, за счет каких форм лейкоци­тов они формируются (нейтрофильный, эозинофильный, базофильный, лимфоцитоз и мо-ноцитоз).

При оценке лейкоцитозов следует учитывать степень зрелости нейтрофилов по индексу ядерного сдвига, который рассчитывается по формуле (используется процентное содержание

клеток):

Миелоциты + юные + палочкоядерные / сегментоядерные

В норме его величина 0,06-0,08. При реактивном лейкоцитозе индекс ядерного сдвига увели­чивается (сдвиг ядра нейтрофилов влево), при перераспределительном лейкоцитозе этот сдвиг отсутствует или выражен незначительно. При тяжелых инфекциях, различных воспалительных процессах, септических состояниях возможно появление дегенеративных изменений в нейтро-филах в виде токсической зернистости цитоплазмы, гиперсегментоза ядра. Это может сопро­вождаться сдвигом ядра нейтрофилов вправо, характеризующимся уменьшением индекса ядер­ного сдвига.

В основе развития лейкопений лежит угнетение лейкопоэза, иногда вплоть до аплазии кро­ветворной ткани, или перераспределение лейкоцитов в сосудистом русле (депонирование). Со­ответственно различают абсолютные и относительные лейкопении. При абсолютной лейкопе­нии часто отмечается сдвиг ядра нейтрофилов вправо.

У большинства больных с острыми воспалительными процессами в челюстно-лицевой области наблюдается нейтрофильный лейкоцитоз с регенераторным сдвигом лейкоцитарной формулы.

При сниженной реактивности организма и развитии хронических форм воспаления не раз­вивается лейкоцитоза, не происходит активации фагоцитарной активности нейтрофилов крови и чисто отмечается снижение показателя завершенности фагоцитоза.

Опыт I. Моделирование лейкоцитоза и лейкопении

Для опыта берут трех мышей. У одной мыши воспроизводят лейкоцитоз путем подкожного введения 0_S2 мл 50% эмульсии скипидара в растительном масле. Через I -2 дня в месте введения развивается гнойное асептическое воспаление, сопровождающееся лейкоцитозом. Для получе­ния экспериментальной лейкопении другой мыши за 3-4 дня до практического занятия под­кожно вводят 0,1-0,2 мл бензола. Третья мышь-контрольная. Вместо мышей можно использо­вать для опыта крыс, которым для воспроизведения лейкоцитоза подкожно вводится 0,5 мл 50% эмульсии скипидара а растительном масле. Для получения лейкопении вводят 0,5 мл бензола.

На занятии мышей наркотизируют (гексенал, тиопентал натрия из расчета 1,0 мл 1% р-ра на 100 г массы), фиксируют, вскрывают грудную полость. Сердце надсекают и Собирают кровь на часовое стекло. В смеситель для лейкоцитов набирают кровь до метки 0,5 и заполняют его 3% раствором уксусной кислоты до метки 11. Смеситель встряхивают в течение 1 -2 мин. Первую каплю из смесителя сбрасывают, а следующую вносят в предварительно подготовленную камеру ГЬряева. Подсчет лейкоцитов производят в 25 больших квадратах под малым увеличением мик­роскопа (об. X 8). Полученное число умножают на 200.

Результаты подсчета лейкоцитов сравнивают, анализируют, делают выводы.

Опыт 2. Изменение лейкоцитарной формулы и определение индекса ядерного сдвига у больных воспалительными процессами челюстно-лицевой области

Подсчет лейкоцитарной формулы в мазках крови окрашенных по Романовскому производят под микроскопом с иммерсионной системой (об. X 90). Следует иметь в виду, что различные форменные элементы распределяются в мазке неравномерно. Более тяжелые клетки (моноци­ты и нейтрофилы) располагаются по периферии мазка, а более легкие (лимфоциты) - в центре. Кроме того, наименее деформированные формы сосредоточены в тонкой части мазка. Поэтому предметное стекло передвигают по ломаной линии, захватывая периферические и центральные зоны мазка, преимущественно в тонкой его части (ближе к концу предметного стекла). Обозна­чив отдельные виды лейкоцитов начальными буквами, сосчитывают 200 лейкоцитов и вычис­ляют процентное соотношение отдельных их видов. По степени зрелости раздельно считают только клетки нейтрофильного ряда (промиелоциты, миелоциты, юные, палочкоядерные и сегментоядерные).

Определяют характер изменения лейкоцитарной формулы. Затем производят расчет индекса ядерного сдвига по приведенной выше формуле. На основании анализа лейкоцитарной форму­лы и индекса ядерного сдвига делают выводы.

Занятие 4. ЛЕЙКОЗЫ

Лейкоз - заболевание системы крови опухолевой природы, в основе которого лежит образо­вание клона малигнизированных кроветворных клеток.

Лейкозы делятся на 2 основные группы: острые и хронические. К острым относятся лейкозы, при которых основная масса опухолевых клеток представлена бластами; при хронических - ос­новная масса опухолевых клеток сохраняет способность дифференцироваться до созревающих и зрелых форм. Деление лейкозов на острые и хронические не обусловлено продолжительностью болезни, а определяется степенью нарушения дифференцировки малигнизированных клеток.

Источником образования лейкозного клона клеток, как правило, являются миелоидная или лимфоидная ткани. Соответственно развивается миелоидный или лимфондный лейкоз. Причи­нами возникновения лейкозов является нарушение хромосомного аппарата под влиянием мута­генных факторов (ионизирующее излучение, химические мутагены, вирусы). При лейкозе про­исходит расселение лейкозных клеток-потомков одной, первоначально мутированной клетки.

При остром миелобластном лейкозе источником опухолевого процесса является клетка -предшественница миелопоэза. Источником бластных клеток при остром лимфобластном лей-

козе является клетка-предшествеиница лимфоцитопоэза. При хроническом лимфолейкозе

лейкозные клетки представлены в большинстве случаев В-лимфоцитами, хотя встречают и Г-клеточные лимфолеЙкозы. Имеются также лейкозы, при которых лейкозные клетки относят­ся к В- и I -лимфоцитам.

Лейкозные клетки являются функционально неполноценными; для клеток миелоидного

ряда характерно снижение миграционной способности, фагоцитарной активности, выделения факторов неспецифической гуморальной защиты; для клеток лимфоидного ряда функцио­нальная недостаточность проявляется в снижении гуморального (антителогенез) и клеточного

иммунитета.

Острый лейкоз наиболее часто протекает на фоне умеренного лейкоцитоза или лейкопении, тогда как хронический часто сопровождается очень высоким лейкоцитозом. В крови появля­ются властные клетки и малодифференцированные формы, а также атипичные клетки крови.

Морфологически атиличность выражается в полиморфизме и асинхронности развития ядер и

цитоплазмы, изменении размеров клетки, размеров и формы ядра, нуклеол и т. д.

У лейкозных больных развиваются значительные изменения в тканях полости рта, анало­гичные тем, которые встречаются в других органах. Это - лейкемическая инфильтрация десен, языка, неба, слюнных желез, миндалин, вызывающая их гипертрофию, язвенно-некротические и воспалительные процессы, геморрагии, особенно на слизистой оболочке. Вследствии лейке-мической инфильтрации челюстей активируется процесс резорбции костной ткани, в первую очередь в альвеолярных костях. При остром лейкозе патологические изменения в полости рта могут развиваться уже в начале заболевания и протекают очень активно. Эти изменения зависят также от вторично развивающейся анемии и тромбоцитопении.

Цель занятия: изучить мазки периферической крови больных различными формами лейкоза и гистохимические особенности лейкозных клеток пои острых лимфо- и миелолейкозах

Опыт 1. Изучение мазков периферической крови больных лейкозами

Мазки периферической крови больных острыми лейкозами, хроническими миело- и лимфо-лейкозами, окрашенные по Романовскому, студенты изучают под микроскопом с иммерсион­ной системой (об. X 90) и зарисовывают характерную картину крови.

Обращают внимание, что при остром лейкозе в периферической крови содержится значи­тельное количество бластных клеток, почти полностью отсутствуют созревающие и дифферен­цированные формы.

При хроническом лимфолейкозе в мазках крови преобладают зрелые лимфоциты, переход­ные формы (типа пролимфоцита), встречаются единичные бластные клетки; можно обнаружить типичные клетки (тени) лимфолиза - клетки Боткина-Гумпрехта.

При хроническом миелолейкозе в мазках периферической крови присутствуют все морфо­логически дифференцированные клетки гранулопитарного ряда (промиелоциты, миелоциты, юные, палочкоядерные, сегментоядерные, встречаются единичные миелобласты), однако пре­обладают зрелые формы. Часто отмечается увеличение числа эозинофилов и базофилов (базо-фильно-эозинофильные ассоциации). Зарисовывают картину периферической крови при раз­личных формах лейкоза, делают выводы.

Опыт 2. Цитохимическая характеристика клеток при острых лимфо- и миелолейкозах

Бластные лейкозные клетки при острых лейкозах не могут быть дифференцированы при обычной окраске мазков крови по Романовскому. Поэтому применяют цитохимические метоэ^ ды, которые позволяют выявить особенности химического состава и ферментативной актив­ности бластных клеток лимфоидного и миелоидного ряда. Применяют методы, позволяющие выявить гликоген (окраска по Шабадашу), липиды (окраска Суданом III) по методу Гольдма-на, миелопероксидазу (по методу Грэхема - Кнолля). Гликоген распределен в цитоплазме в виде глыбокили диффузно. Глыбки вишнево-фиолетового цвета, по интенсивности которого можно судить о содержании гликогена. Липиды выявляются в виде оранжевых зерен, миелопероксида-за определяется в цитоплазме в виде коричневых гранул.

На занятии студенты изучают готовые мазки периферической крови больных острыми лей­козами.