5.6.3. Натриевые каналы

 

Целый ряд данных свидетельствует о том, что при возбуждении мембраны ионы натрия проходят через специальные каналы, избирательно проницаемые для этих ионов (табл. 5–1), причем число каналов ограничено. Натриевые каналы активируются (т.е. открываются и пропускают ионы) в ответ на деполяризацию, при этом они проявляют высоко избирательную проницаемость для Li⁺ и Na⁺ по сравнению с другими ионами (рис. 5–25). Такое свойство обусловлено особой структурой каналов, благодаря которой они играют рольизбирательных (селективных) фильтров. Поскольку в норме ионы лития в организме практически отсутствуют, весь ток, проходящий через эти каналы, переносится ионами Na⁺; ионы же Са^2 + и К ⁺ через них почти не проходят.

 

Li+	Na+	NH4+	Ca2+	K+	Rb+	Cs+
1,1	1,0	0,27	0,1	0,083	0,025	0,016

 

 

 

Рис. 5.25. Относительная проницаемость натриевого канала аксона кальмара для ионов Na+ и других ионов, способных проходить через этот канал; коэффициент проницаемости для Na + принят за 1. (Нillе, 1985.)

 

 

Процессы, приводящие к открыванию или закрыванию каналов (например, натриевого канала при деполяризации мембраны), называются воротными. Детальный механизм этих процессов пока неизвестен. По–видимому, в покое натриевый канал механически перекрыт некой заряженной структурой (рис. 5–26,А). При деполяризации мембраны конформация этой структуры изменяется и канал открывается (рис. 5–26,Б). Главный аргумент в пользу того, что в мембране действительно происходят подобные механические конформационные перестройки,– это обнаружение так называемых воротных токов, возникающих при открывании и закрывании натриевых каналов. Эти очень слабые токи можно зарегистрировать, если активировать натриевые каналы, предварительно заблокировав их с помощью фармакологических препаратов с тем, чтобы через них не мог протекать гораздо более мощный ионный ток. Полагают, что воротные токи, связаны с перемещением заряженных группировок, приводящим к открыванию активационных ворот (m–ворот) при активации каналов. В некоторых клетках обнаружены аналогичные воротные токи калиевых и кальциевых каналов.

 

Рис. 5.26. Основные состояния натриевых каналов. А. В покое (мембрана не деполяризована) канал не пропускает ионы Na +, поскольку закрыты т–ворота. Б. При деполяризации т–ворота открываются, и канал активируется (т.е. начинает пропускать ионы Na + ). Из–за этого т–ворота называют также активационными. В открытом состоянии проводимость канала в значительной степени определяется его селективным фильтром, который не пропускает анионы и гораздо более охотно пропускает Na+, чем К+ или Са2+. В. При более длительной деполяризации закрываются h–вopoma (инактивационные ворота), расположенные у внутренней стороны мембраны, и канал инактивируется. Реполяризация до уровня потенциала покоя вновь приводит к открыванию h–вopom и закрыванию т–ворот; в этом состоянии канал вновь можно активировать деполяризующим стимулом.

 

 

Здесь может возникнуть вопрос: каким же образом деполяризация мембраны приводит к открыванию электроуправляемых каналов (например, натриевых)? Представим себе типичную возбудимую клетку в состоянии покоя. Ее мембранный потенциал составляет –75 мВ. Деполяризация на 50 мВ (т. е. до – 25 мВ) обычно приводит к активации большей части натриевых каналов, расположенных в мембране. Эти каналы представляют собой молекулы белка, вкрапленные в мембранный липидный бислой толщиной порядка 5 нм. Значит, при деполяризации на 50 мВ в этом бислое (а следовательно, и в расположенных в нем воротных белках) возникает изменение напряжения 10^–3 В на 10^–8 см, т.е. 100 000 В/см. Неудивительно, что заряженные группировки белков–каналов «чувствуют» такие изменения и отвечают на них конформационными перестройками каких–то участков белковых молекул. Считают, что эти конформационные перестройки и лежат в основе воротных процессов, управляющих электровозбудимыми каналами.

При длительной деполяризации натриевые каналы инактивируются. Инактивация развивается в мембране автоматически, и степень ее зависит от мембранного потенциала и времени. Постоянная времени инактивации (То есть, в течение которого проводимость снижается в ераз.– Прим. перев.) составляет менее 2 мс (рис. 5–24,Б). Инактивацию можно подавить, введя в цитоплазму протеолитические ферменты. Это позволяет думать, что в инактивации принимает участие некая белковая структура, расположенная у внутреннего входа натриевого канала – инактивационных ворот (h–ворот). h–Ворота закрываются через несколько миллисекунд после открывания m–ворот. По–видимому, закрывание h–ворот как–то зависит от  пребывания m–ворот в открытом состоянии.

                Тетродотоксин (ТТХ) – вещество, выделенное из внутренних органов иглобрюха (рыбы, обитающей у берегов Японии), способен внедряться в натриевые каналы и блокировать их (рис. 5–27). Опыты, проведенные на различных видах нервов, показали, что натриевые каналы на участке мембраны аксона площадью 1 мкм² связывают менее 100 молекул ТТХ. При этом полностью подавляется увеличение натриевой проводимости, возникающее в норме при деполяризации (табл. 5–1). Кинетические особенности блокирования каналов свидетельствуют о том, что каждая молекула ТТХ связывается с одним натриевым каналом. Значит, число каналов на 1 мкм² мембраны составляет менее 100. Если бы все эти каналы открывались одновременно, то площадь их сечения должна была бы составлять менее 1/50 000 от поверхности мембраны, если считать, что диаметр канала составляет порядка 0,5 нм (рис. 5–27,Б). То, что на долю канала приходится столь малая часть поверхности мембраны, вполне согласуется с моделями клеточных оболочек Даниелли и Сингера (разд. 4.2.1). Согласно этим моделям, низкая проницаемость мембраны для полярных молекул обусловлена тем, что большую ее часть занимает сплошной липидный бислой. Чрезвычайно малая площадь канала объясняет также и то, почему при тех значительных изменениях проводимости, которые наблюдаются при возбуждении мембран, не происходит каких–либо существенных изменений емкости мембраны.

 

Рис. 5.27. Структурная формула яда иглобрюха–тетродотоксина (ТТХ)–и его действие. А. Структурная формула ТТХ. Закрашенный квадратик – гуанидиновая группировка, которая может входить в устье натриевом канала и блокировать его. Б. Предполагаемая пространственная структура ТТХ и его расположение в натриевом канале. (Нillе, 1975.) В. Влияние ТТХ на ранний входящий ток. Кривые записаны с интервалами 15 с после воздействия на аксон кальмара ТТХ в концентрации 1,5–10 –7 М. Видно, что ранний ток уменьшается, а поздний остается без изменений. (Moor, Narahashi, 1967.)

 

 

В 1980 г. Фредерик Сигворс и Эрвин Неер с помощью так называемого метода локальной фиксации (patch–clamp) (рис. 5–28,А) смогли зарегистрировать ток через одиночный натриевый канал, активированный с помощью деполяризации. Для этого они использовали микропипетку диаметром 0,5 мкм, в кончик которой втягивали участок мембраны для создания тесного контакта между пипеткой и мембраной. Оказалось, что токи через одиночные каналы подчиняются закону «все или ничего», имеют прямоугольную форму (это свидетельствует об очень быстром открывании и закрывании каналов) и одинаковы по величине для разных каналов (рис. 5–28,Б). При этом длительность пребывания каналов в открытом состоянии варьирует случайным образом и довольно широко. Среднее время нахождения канала в открытом состоянии составляет менее 1 мс и зависит от мембранного потенциала: при смещении деполяризующего потенциала в положительную сторону это время уменьшается. В то же время проводимость одиночных натриевых каналов слабо зависит от напряжения и равна примерно 10 пСм (т. е. 10·10^–12 См, что соответствует сопротивлению 10¹¹ Ом). Используя закон Ома, постоянную Фарадея и число Авогадро, находим, что при V_м –E_Na = –100 мВ (примерно такова электродвижущая сила для Na ⁺ в начале развития ПД) активированные натриевые каналы пропускают примерно 6000 ионов натрия за 1 мс. Тот значительный натриевый ток, который отвечает за фазу подъема ПД, равен сумме тысяч чрезвычайно слабых импульсных одиночных токов, обусловленных срабатыванием (т. е. открыванием и закрыванием) натриевых каналов. Число каналов, открытых в каждый момент времени, зависит от мембранного потенциала, а также от времени, поскольку от времени зависят процессы, приводящие к активации и инактивации каналов. Таким образом, суммарные, зависящие от потенциала и времени изменения натриевой проводимости мембраны (рис. 5–29) порождаются воротными процессами в тысячах натриевых каналов, каждый из которых в ответ на деполяризацию открывается и закрывается в соответствии с определенными вероятностными закономерностями.

 

Рис. 5.28. Запись активности одиночного канала с помощью метода локальной фиксации. А. Оплавленную стеклянную микропипетку с диаметром кончика около 2 мкм, заполненную солевым раствором, слегка прижимают к очищенной поверхности мембраны, и участок мембраны под кончиком всасывают в пипетку. При этом между пипеткой и мембраной создается очень плотный контакт, препятствующий утечке тока «мимо» микропипетки. Ток, протекающий через открытый канал, подается на вход усилителя, с помощью которого напряжение фиксируется на участке мембраны примерно таким же способом, как в классической методике фиксации потенциала, описанной в дополнении 5–3. Б. Деполяризация (верхняя кривая) участка мембраны мышечной клетки крысы приводит к кратковременному открыванию натриевого канала. Срабатывания каналов проявляются в виде «всплесков» тока различной длительности с разным латентным периодом (нижние кривые). В. Суммарный ток, полученный в результате сложения 144 кривых, записанных от одного участка мембраны. Динамика этого тока отражает распределение во времени отдельных срабатываний одиночного канала в ответ на деполяризующий стимул. Видно, что эта динамика сходна с временным ходом макроскопического натриевого тока (рис. 5–24,В), отражающего открывание многих каналов в ответ на одиночный деполяризующий стимул. (Кривые Б и Ввоспроизведены из работы Patlack, Horn, 1982.)

 

Рис. 5.29. А. Временное изменение натриевой проводимости при подаче деполяризующих импульсов разной величины (высота импульсов в милливольтах указана над кривыми). (Hodgkin, 1958.) Б. Зависимость максимальной величины gNa от степени деполяризации. Ноль соответствует исходному фиксированному потенциалу (около — 70 мВ). Эта экспериментальная кривая сходна с расчетной кривой В в дополнении 5–4. (Hodgkin, Huxley, 1952b.)