5.6.2. Натриевая гипотеза

 

Многим из того, что мы знаем сегодня об электровозбудимых мембранах, мы обязаны сообщению, сделанному в 1936 г. английским зоологом Джоном Юнгом. Этот ученый обнаружил, что особые длинные тяжи у кальмаров и каракатиц (рис. 5–19) являются не кровеносными сосудами, как считалось ранее, а необычайно толстыми аксонами.

 

Рис. 5.19. Кальмар Loligo и его гигантские аксоны. Благодаря своим крупным размерам эти аксоны быстро проводят возбуждение и тем самым обеспечивают достаточно синхронную активацию мышц мантии. Сокращаясь, эти мышцы вызывают резкий выброс воды, и потревоженный кальмар делает бросок назад. (Keynes, 1958.)

 

Они получили название гигантских аксонов и стали излюбленным объектом для изучения функций мембран; благодаря их очень большому диаметру (до 1 мм) можно было вводить в них в продольном направлении проволочные электроды и записывать потенциалы (рис. 5–20,А).

 

Рис. 5.20. А. Схема опыта, в котором Ходжкин и Хаксли в 1939 г. на аксоне кальмара показали, что во время ПД мембранный потенциал меняет свой знак на противоположный. Стрелками указано направление распространения возбуждения. Б. Запись, полученная в данном опыте.

 

Первые крупные открытия, связанные с экспериментами на гигантских аксонах кальмара, были сделаны в 1939 г. независимо друг от друга Кеннетом Коулом и Говардом Кертисом (Вудс–Хол, Массачусетс), с одной стороны, и Аленом Ходжкином и Эндрью Хаксли (Плимут, Великобритания) – с другой. Коул и Кертис показали, что во время ПД проводимость мембраны возрастает без каких–либо существенных изменений ее емкости (рис. 5–21). Ходжкин и Хаксли обнаружили, что мембранный потенциал во время ПД не просто уменьшается до нуля, но меняет свой знак на противоположный (рис. 5–20, Б). Этот факт противоречил распространенной в то время гипотезе о том, что увеличение ионной проницаемости во время возбуждения нош неспецифический характер (т. е. мембрана становится проницаемой в одинаковой степени для всех ионов) и что ПД обусловлен просто–напросто полной деполяризацией мембраны.

 

Рис. 5.21. Увеличение проводимости мембраны во время распространения ПД в аксоне кальмара. На этом классическом рисунке Коула и Кертиса (1939 г.) приведены ПД и контуры высокочастотного колебания, ширина которого пропорциональна проводимости мембраны. Видно, что во время ПД и в течение короткого промежутка после него проводимость увеличена. Повторив этот опыт с колебаниями разной частоты, Коул и Кертис обнаружили, что емкость мембраны во время возбуждения не меняется. Интервал между отметками времени (внизу) –1 мс.

 

Рис. 5.22. Зависимость величины овершута ПД гигантского аксона кальмара от содержания Na+ во внешней среде. 1 – контрольная кривая, полученная при нормальном составе среды (морская вода). Кривые 2–5соответствуют постепенному изменению конфигурации ПД при замене среды, сходной с морской водой, на раствор, содержащий холинхлорид вместо NaCl; при этом концентрация Na+ вблизи мембраны, т. е. под слоем прилегающих к ней тканей, постепенно снижалась. Кривая 6 получена после того, как раствор был вновь заменен на морскую воду. (Hodgkin, Katz, 1949.)

 

 

В дальнейшем Ходжкин и Бернард Катц (1949) обнаружили, что если удалить из внеклеточной среды Na⁺ , то ПД не возникает. Если же заменить внеклеточный Na⁺ на непроникающий катион (например, холин), то скорость деполяризации и амплитуда ПД снижается (рис. 5–22). На основании этих данных они высказали так называемую натриевую гипотезу, согласно которой фаза подъема и овершут ПД обусловлены временным повышением проницаемости мембраны для Na⁺ и входом этого иона в клетку.

В пользу натриевой гипотезы говорят следующие соображения и факты.

 

1. Содержание Na⁺ во внеклеточной среде примерно в 10 раз больше, чем в клетке, поэтому Е_Na составляет 50–60 мВ. Направление действующей на ионы Na⁺ ЭДС таково, что эти ионы стремятся пройти в клетку. Численно эта ЭДС равна V_M — Е_Na (разд. 5.5).

2. Поскольку ионы Na⁺ заряжены положительно, их вход в клетку должен привести к изменению знака внутриклеточного потенциала на положительный (что, как мы уже знаем, и наблюдается в действительности).

3. На высоте овершута ПД приближается к равновесному натриевому потенциалу. Этот потенциал [см. уравнение (5–5)] можно рассчитать исходя из того, что отношение содержания Na ⁺ в наружной и внутриклеточной средах равно 10:1:

 

Е_Na = RT / FZ  ln Na⁺₀ / Na⁺_i  = 0,058 lg 10 = 0,058 В = 58 мВ.

 

4. Как мы уже отмечали, величина овершута зависит от содержания Na⁺ во внеклеточной среде, причем эта зависимость соответствует теоретической, которую можно найти исходя из значения Е_Na

 

Во время второй мировой войны Ходжкин и Хаксли вынуждены были временно прекратить свои работы на гигантских аксонах кальмара. После войны они вновь приступили к опытам, но уже с использованием нового и чрезвычайно информативного метода – так называемого метода фиксации потенциала (см. дополнение 5–3). Этот метод позволил им получить дополнительные данные в поддержку натриевой гипотезы. В двух словах в методе фиксации потенциала (впервые примененном на гигантском аксоне кальмара) используется система с обратной связью, позволяющая скачкообразно изменять мембранный потенциал до любого необходимого уровня и поддерживать (фиксировать) его на этом уровне; в опыте измеряется ионный ток. протекающий через мембрану при подобном изменении потенциала. При такой постановке эксперимента исследователь имеет дело с меньшим числом неконтролируемых факторов, чем в том случае когда на мембране в ответ на импульс деполяризующего тока свободно развивается ПД (см. рис. 5–5. и 5–15). Метод фиксации потенциала оказался чрезвычайно плодотворным для изучения работы потенциалзависимых каналов, по которым такие ионы, как Na⁺ и К ⁺ , проходят через мембрану и вызывают изменение мембранных потенциалов.

Из рис. 5–23 видно, что в ответ на действие гиперполяризующего потенциала (кривая а) через мембрану начинает течь очень небольшой и постоянный входящий ток (кривая а), который сохраняется в течение всего времени гиперполяризации. Однако такой же по величине деполяризующий сдвиг потенциала (кривая б) сопровождается более значительными и сложными изменениями мембранных токов (кривая б'). Вначале кривая б кратковременно отклоняется вниз. Это означает, что в ответ на деполяризацию очень быстро возникает входящий ток. Этот ранний входящий ток сохраняется в течение 1 – 2 мс, а затем сменяется более медленно развивающимся задержанным выходящим током (отклонение кривой вверх). Ранний входящий ток вызвал особый интерес, поскольку он порождается проникновением положительных зарядов в клетку и, следовательно, его можно связать с фазой нарастания ПД, обусловленной, как предполагалось, входом Na ⁺ . (для обозначения фазы нарастания ПД широко используются также термины «фаза деполяризации» или «передний фронт».– Прим. перев.)

 

Рис. 5.23. Кривые, полученные в опыте с фиксацией потенциала. При гиперполяризации (кривая а.) наблюдается лишь небольшой постоянный мембранный ток (а´). При деполяризации же сначала возникает входящий ток (кривая б', отклонение вниз), а затем наблюдается медленно развивающийся задержанный выходящий ток (кривая б', смещение вверх). (Hodgkin, Huxley, Katz, 1952.)

 

Рис. 5.24. Разграничение натриевого и задержанного выходящего токов. А. Кривая изменения мембранного потенциала; ступенчатая деполяризация на 60 мВ. Б. Кривая а соответствует суммарному току, переносимому ионами Na+ и К+ в условиях нормального состава внеклеточной среды (морская вода); кривая ботражает лишь ток, переносимый ионами К +, поскольку она была получена при таком снижении содержания Na+ во внешней среде, когда VM во время подачи стимула был равен равновесному натриевому потенциалу; значит, хотя натриевые каналы и были открыты, ток через них не шел. В. Кривая, соответствующая натриевому току, получена путем вычитания кривой б из кривой a. (Hodgkin, Huxley, 1952а.)

 

 

Для проверки предположения о том, что ранний входящий ток обусловлен ионами натрия, Ходжкин и Хаксли заменили эти ионы во внеклеточной среде на холин. Ранний входящий ток исчез (рис. 5–24), вместо него наблюдался лишь небольшой ранний выходящий ток. Что же касается задержанного выходящего тока, то он в этих условиях не изменялся. Если аксон вновь погружали в среду с нормальным содержанием натрия, то входящий ток восстанавливался. Такое восстановление свидетельствовало о том, что этот входящий ток обусловлен временным входом Na⁺ через мембрану в клетку. В соответствии с такой точкой зрения деполяризующий импульс приводит к кратковременному открыванию большого числа натриевых каналов, через которые ионы Na⁺ входят в аксон (создается натриевый ток). Иными словами, открывание натриевых каналов приводит к повышению натриевой проводимости g_Na. При обычном составе внеклеточной жидкости направление электрохимического градиента, действующего на Na⁺ (V_M — Е_Na), таково, что этот ион стремится войти в клетку. Значит, при повышении g_Na возрастает и натриевый ток:

 

I_Na =g_Na(V_M – E _Na)                                                        (5–11)

 

При замене Na⁺ во внеклеточной среде на такой непроникающий ион, как холин, электрохимический градиент для Na⁺ меняет свой знак на противоположный, и направление натриевого тока также становится обратным.

Ходжкин и Хаксли сумели исследовать раздельно временной ход входящего и задержанного выходящего токов. Для этого они сначала регистрировали суммарный ток в препарате, погруженном в нормальный физиологический раствор, а затем снижали содержание натрия во внеклеточной среде, заменяя его на холин. При этом они создавали такую концентрацию Na⁺ , чтобы при том уровне потенциала, который они подавали на мембрану, эти ионы находились в равновесии (т. е. V_M – E _Na = 0) (рис. 5–24). В этих условиях в ответ на подачу деполяризующего потенциала натриевый ток уже не возникал, и оставался лишь задержанный выходящий ток (рис. 5–24,Б). В дальнейшем было показано (см. ниже), что носителями этого тока являются ионы К ⁺ . Ходжкин и Хаксли вычли задержанный выходящий ток из суммарного тока, который регистрировался при нормальном составе внеклеточной среды. Разность между двумя этими токами (на рис. 5–24, Б закрашенная область) и принималась за величину входящего тока, переносимого ионами Na⁺ (рис. 5–24,Б).

Что же мы можем сказать о свойствах мембраны исходя из особенностей натриевого тока? Прежде всего напомним, что, согласно закону Ома, натриевый ток I_Na зависит от двух величин [см. уравнение (5–11)]: 1) проводимости мембраны для Na ⁺ , g_Na; 2) действующей на ионыNa⁺ электрохимической движущей силы (ЭДС), т.е. V_M – E_Na. Значит, если резко деполяризовать мембрану до нового фиксированного потенциала, то временной ход натриевого тока будет отражать те изменения натриевой проводимости во времени, которые возникают в ответ на деполяризацию. Иными словами, то увеличение I_Na, которое иллюстрирует рис. 5–24, В, дает возможность судить о соответствующем увеличении натриевой проводимости. Как мы видим из рисунка, несмотря на то что уровень деполяризации (т.е. V_M) удерживается постоянным, натриевая проводимость сначала (в пределах 1 мс) достигает максимума, а затем быстро спадает и возвращается к исходному уровню (рис. 5–24,Б). Это означает, что в мембране протекают два разных процесса. Первый из них – увеличение натриевой проводимости при деполяризации – называется активацией, второй – постепенное, или зависящее от времени, снижение натриевой проводимости до исходного уровня – инактивацией.