3.5.9. Подавление активности ферментов

 

Некоторые молекулы способны подавлять (ингибировать) активность ферментов. Ингибирование ферментов в живой клетке служит одним из средств регуляции ферментативных реакций. Благодаря исследованиям молекулярных механизмов ингибирования энзимологам удалось установить ряд важных особенностей, касающихся активного центра фермента и механизма действия ферментов.

Ферменты могут быть выведены из строя веществами, которые образуют очень прочные ковалентные связи с группами, расположенными внутри активного центра, и которые препятствуют тем самым образованию комплекса ES. Взаимодействия такого рода могут привести к необратимому ингибированию. Для внутриклеточных процессов в норме, однако, более характерно обратимое ингибирование двух типов. Первый – конкурентное ингибирование – становится все более эффективным при увеличении концентрации субстрата, тогда как второй – неконкурентное ингибирование –– от концентрации субстрата не зависит. Установлено, что конкурентные ингибиторы реагируют непосредственно с активным центром фермента, тогда как неконкурентные – с участком фермента вне активного центра. Конкурентные ингибиторы (рис. 3–23) представляют собой обычно структурные аналоги субстрата, неконкурентные же ингибиторы, напротив, могут совершенно не походить по химической структуре и составу на субстрат. Конкурентный ингибитор конкурирует с молекулами субстрата за активный центр. Поэтому при увеличении концентрации одного из этих компонентов уменьшается вероятность связывания другого. Поскольку неконкурентный ингибитор связывается с участком фермента вне активного центра, молекулы субстрата не могут конкурировать с ним за его место связывания, поскольку не обладают сродством к аллостерическому центру.

 

Рис. 3.23. Конкурентный ингибитор связывается с активным центром фермента, препятствуя тем самым связыванию субстрата. Он может вытесняться молекулой субстрата

 

 

Конкурентное и неконкурентное ингибирование легко различить с помощью графиков Лайнуивера – Бэрка. В присутствии конкурентного ингибитора наклон прямой увеличивается, что соответствует уменьшению скорости реакции (рис. 3–24, А). Однако, несмотря на увеличение наклона, величина отрезка, отсекаемого этой прямой от оси 1/v₀, остается прежней; другими словами, если провести экстраполяцию к бесконечной концентрации субстрата (т.е. к точке 1/[S] = 0), то окажется, что скорость реакции не зависит от присутствия конкурентного ингибитора. Это объясняется тем, что по мере увеличения концентрации субстрата последний все более успешно конкурирует с ингибитором за активный центр и в конце концов полностью вытесняет ингибитор в гипотетической ситуации при бесконечной концентрации субстрата. Зная длину отрезка, отсекаемого прямой от оси 1/[S], мы можем найти константу К_м. Из рисунка видно, что последняя, растет по мере увеличения концентрации [I] конкурентного ингибитора. Это просто означает, что в присутствии конкурентного ингибитора требуется большая концентрация субстрата для того, чтобы в начальном периоде реакции половина всех молекул фермента находилась в комплексе с субстратом. Этот эффект выражен тем сильнее, чем больше [I]. Чем прочнее ингибитор связывается с ферментом (т. е. чем меньше константа диссоциации К_I комплекса фермент–ингибитор), тем большая концентрация субстрата требуется для того, чтобы вытеснить соответствующую долю ингибитора из комплекса с ферментом.

В присутствии неконкурентных ингибиторов также наблюдается увеличение наклона прямой на графике Лайнуивера – Бэрка (рис. 3–24, Б), однако этот эффект сопровождается уменьшением скорости реакции при бесконечной концентрации субстрата. На графике это уменьшение выражается в увеличении ординаты точки пересечения прямой с осью 1/v₀. Эти кинетические эффекты объясняются тем, что повышение концентрации субстрата не приводит к уменьшению концентрации неконкурентного ингибитора на аллостерических центрах фермента. Данная ситуация эквивалентна полному выведению из оборота тех молекул фермента, которые ассоциированы с ингибитором. При этом прямые пересекают ось 1/[S] в одной и той же точке независимо от того, есть или нет в системе неконкурентный ингибитор, т.е. присутствие последнего никак не сказывается на величине К_м фермент–субстратного комплекса. Как мы только что отмечали, эффект, вызванный присутствием неконкурентного ингибитора, эквивалентен уменьшению концентрации фермента. Поэтому неудивительно, что К_мфермент–субстратного комплекса остается неизменным при добавлении неконкурентного ингибитора, потому что К_м не зависит от [Е].

 

Рис. 3.24. Графики Лайнуивера–Бэрка для случая конкурентного (А) и неконкурентного (Б) ингибирования. Видно, что Км зависит от концентрации конкурентного ингибитора. Кинетический эффект от присутствия неконкурентного ингибитора эквивалентен уменьшению концентрации фермента, что никак не сказывается на величине Км. Здесь I  ингибитор, S– субстрат, КI–константа диссоциации комплекса фермент–ингибитор. (Lehninger, 1975.)