3.5.8. Сродство между ферментом и субстратом

 

Максимальная скорость V_max любой ферментативной реакции достигается в тот момент, когда весь фермент, катализирующий эту реакцию, связан, или насыщен, субстратом, т. е. когда S присутствует в избытке, а лимитирующим компонентом является Е (рис. 3–20). Любая ферментативная реакция характеризуется своим значением V_mах. Эффект насыщения имеет место у всех ферментов, однако среди фермент–субстратных пар наблюдается большой разброс концентраций субстрата, при которых происходит насыщение. Это обусловлено различиями в сродстве между ферментом и субстратом. Чем сильнее тенденция к образованию фермент–субстратного комплекса ES, тем большая доля от полного количества Е_полн фермента будет находиться в составе комплекса ES при любой фиксированной концентрации субстрата. Или, что то же самое, чем больше сродство, тем меньшая концентрация субстрата требуется для насыщения фермента.   Между кинетикой реакции

Е

S  P

и сродством S к Е существует тесная связь. Общая теория механизма и кинетики ферментативных реакций была предложена Леонором Михаэлисом и Мод Л. Ментен в 1913 г. и позднее уточнена Джорджем Э. Бриггсом и Джоном Б. С. Холдейном. Их выход уравнения, где фигурирует константа К_м, можно найти практически в любом учебнике по биохимии. Уравнение Михаэлиса – Ментен дает выражение для начальной скорости v₀ односубстратной реакции:

 

v₀ = V_max S  /  K_M + S                                              (3–7)

 

где [S] – концентрация субстрата, V_max – скорость реакции при избытке субстрата, К_м  – константа Михаэлиса. Рассмотрим частный случай, когда v₀ = ½ V_max. Подставив его выражение в (3–7), имеем

 

V_max / 2 = V_max S / K_M + S.                                  (3–8)

 

Поделив обе части равенства на V_max, получим

 

½ = [S] / K_M +  S                                                    (3–9)

 

После некоторых преобразований получаем

 

K_M + S = 2 [S].                                                       (3–10)

или

 

K_M  = S                                                             (3–11)

 

Таким образом, К_м численно равна концентрации субстрата, при которой начальная скорость реакции составляет половину скорости, достигаемой при насыщении фермента субстратом.

Это означает, что константа Михаэлиса К_M (измеряемая в молях на литр) зависит от сродства между ферментом и субстратом. Для любой пары фермент–субстрат она численно равна концентрации субстрата, при которой начальная скорость реакции составляет – ½V_max. Отсюда следует, что при концентрации субстрата, равной К_м, половина всего наличного фермента связывается с субстратом, т.е. при данной концентрации [Е_полн ]/[ES] = 2. Чем больше сродство между ферментом и субстратом, тем меньше К_м этого фермент–субстратного взаимодействия. Иначе говоря, величина 1/К_м служит мерой сродства между ферментом и его субстратом. Как показано на рис. 3–21, где изображены графики зависимости v₀ от [S] для двух концентраций фермента, К_м не зависит от концентрации фермента.

 

Рис. 3.21. Константа Михаэлиса Км численно равна концентрации субстрата, при которой начальная скорость реакции составляет половину максимальной. Черная и цветная кривые отвечают различным концентрациям фермента. Обратите внимание, что Км не зависит от [E].

 

Приведенные на рис. 3–21 кривые, согласно уравнению (3–7), являются графиками гиперболических функций, которые в данной системе координат невозможно построить иначе, как на основе большого числа экспериментальных точек. Это  уравнение, однако, легко преобразовать к зависимости Лайнуивера – Бэрка, и тогда соответствующий график можно без труда построить всего лишь по нескольким экспериментальным точкам:

 

1/v₀ = K_M /V_max 1/S + 1/V_max                                     (3–12)

 

В координатах (1/v₀; 1/[S]) график этой зависимости является прямой с наклоном K_M /V_max, которая пересекает оси 1/V₀  и 1/[S] в точках l/V_max и – 1/К_м (рис. 3–22). Таким образом, для построения графика достаточно знать лишь V_max и определить v₀ для какого–либо значения [S]. Найдя точку пересечения прямой с осью абсцисс, получим К_м.

 

Рис. 3.22. График Лайнуивера–Бэрка, представляющий зависимость обратной скорости реакции 1/v0 от обратной концентрации субстрата 1/[S]. Прямая пересекает ось абсцисс в точке — 1/[S] = — 1/Км, а ось ординат – в точке 1/v0 = 1/Vmax (Patton, 1965.)

 

Следует отметить, что модель Михаэлиса – Ментен не ограничивается случаем фермент–субстратных взаимодействий, но может применяться (а часто и применяется) к любой системе, для которой характерна гиперболическая зависимость скорости реакции при стремлении к насыщению, подобная той, что изображена на рис. 3–20. Пример такого рода приведен на рис. 4–27.