6.8. Выделение медиаторов пресинаптическими окончаниями

 

Эффективность синаптической передачи зависит от выделения медиатора из пресинаптического окончания. В самом деле, величина постсинаптического потенциала определяется числом молекул медиатора, высвобождаемых в синаптическую щель. Значит, для того чтобы разобраться в механизме синаптической передачи, необходимо выяснить, каким образом происходит высвобождение медиатора из синаптического окончания. Этот вопрос важен не только сам по себе как одна из проблем физиологии; помимо этого история изучения механизма выделения медиатора дает нам немало ярких примеров успешной разработки научной методологии и экспериментальных подходов. Одним из наиболее выдающихся примеров такого рода служит доказательство того, что медиаторы обычно выделяются квантами. Этому и будет посвящен следующий раздел.

 

 

6.8.1. Квантовое выделение медиаторов

 

Изучая механизмы нервно–мышечной передачи, Пол Фетт и Бернард Катц в 1952 г. зарегистрировали миниатюрные (амплитудой менее 1 мВ) спонтанные деполяризующие потенциалы, которые можно было записать лишь в области постсинаптической мембраны двигательной концевой пластинки мышцы лягушки (рис. 6–30). По мере удаления внутриклеточного регистрирующего электрода от концевой пластинки эти потенциалы становились все меньше. Поскольку по своей форме, динамике и чувствительности к различным препаратам они были сходны с ПКП, исследователи назвали их миниатюрными потенциалами концевой пластинки (МПКП). Далее мы увидим, что регистрация этих потенциалов сыграла важную роль в понимании механизмов выделения медиаторов.

 

Рис. 6.30. Спонтанные миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП), записанные от области двигательной концевой пластинки волокна скелетной мышцы. Видно амплитуда МПКП невелика и непостоянна.

 

 

Катц и его сотрудники решили исследовать, как связаны эти спонтанные миниатюрные потенциалы с обычными ПКП, возникающими при возбуждении двигательных нервов. Они предположили, что МПКП соответствуют выделению «кванта» медиатора, а нормальный ПКП складывается из многих таких квантов, высвобождаемых одновременно в ответ на поступление импульса в пресинаптическое волокно. Для того чтобы проверить это предположение, они использовали тот уже известный факт, что при постепенном повышении во внеклеточной среде концентрации Mg²⁺ и(или) снижении концентрации Са²⁺ амплитуда обычного, вызванного раздражением нерва ПКП убывает. Подробно изучив эту зависимость, исследователи обнаружили, что при соответствующих концентрациях этих катионов величина ПКП становится равной амплитуде одиночного спонтанного МПКП или сумме нескольких таких МПКП. Измерив постсинаптические потенциалы, возникающие в ответ на поступление импульсов в пресинаптические окончания двигательных нервов в условиях высокой концентрации Mg²⁺ и низкой – Са²⁺ и соответствующим образом статистически обработав данные, Катц с сотрудниками пришел к следующим выводам.

1. В некоторых случаях поступление ПД к двигательному окончанию не вызывает никаких реакций (исследователи назвали подобную ситуацию выпадением).

2. В других случаях в ответ на ПД в пресинаптическом волокне возникают ПКП примерно той же амплитуды, что и одиночные спонтанные МПКП

3. Наконец, в ряде случаев в ответ на ПД в пресинаптическом волокне возникают постсинаптические потенциалы, амплитуды которых кратны средней амплитуде одиночного спонтанного МПКП (т. е. превышают МПКП в 2, 3, 4 и т. д. раз) (pис. 6–31).

Эти данные послужили в дальнейшем подтверждением гипотезы, согласно которой ПКП возник в результате суммации большого числа квантов медиатора, высвобождаемых в ответ на поступление к пресинаптическому окончанию ПД; по отдельности же каждый такой квант вызывает одиночный спонтанный МПКП. Исходя из амплитуды ПКП в мышце лягушки можно сделать вывод, что этот потенциал возникает при одновременном выделении 100–300 квантов ацетилхолина.

 

Рис. 6.31. Выделение медиаторов в двигательной концевой пластинке. А. Нервно–мышечный препарат помещен в  раствор с низким содержанием Са2+. В таком растворе количество медиатора, высвобождаемого при возбуждении двигательного нервного окончания, уменьшается, а амплитуда ПКП варьирует. Б. Вверху: частота возникновения одиночных спонтанных МПКП разной амплитуды (вертикальные столбики), записанных в течение определенного промежутка времени. Внизу: частота возникновения МПКП разной амплитуды, вызванных раздражением двигательного нерва. Видно, что во многих случаях наблюдается «выпадение» МПКП. Для большей части вызванных ПКП (внизу) распределение по амплитудам такое же, как и для одиночных спонтанных МПКП (вверху). Огибающие кривые соответствуют теоретическому распределению Пуассона, полученному в предположении, что вызванные МПКП складываются из одиночных спонтанных МПКП. (Del Castillo, Katz, 1954.)

 

 

При охлаждении нервно–мышечного препарата и соответствующем замедлении высвобождения медиатора из нервного окончания кванты медиатора выделялись не одновременно; при этом фаза нарастания ПКП становилась ступенчатой. Каждая такая ступенька, очевидно, соответствовала отдельному кванту медиатора. Это также свидетельствовало о том, что ПКП формируется в результате суммации эффектов множества квантов медиатора, действующих в нормальных условиях одновременно. Так возникли представления о квантовом выделении медиаторов. Далее Катц и его сотрудники задали себе простой, прямой, но важный вопрос: что же физически представляет собой один квант медиатора, соответствует ли он одной молекуле АцХ, и если нет, то какому количеству этих молекул? Если бы спонтанные МПКП были обусловлены действием одиночных молекул АцХ, «просачивающихся» из пресинаптического окончания, то добавление в среду, где находится препарат, ацетилхолина до очень низкой концентрации вызвало бы резкое увеличение числа МПКП. Катц с сотрудниками использовали вначале крайне низкие концентрации АцХ и постепенно повышали их.

Однако при этом они ни разу не зарегистрировали увеличение числа МПКП, а по мере увеличения концентрации АцХ наблюдали плавно нарастающую деполяризацию. Из этого они заключили, что МПКП не возникают в ответ на действие отдельных молекул АцХ. По их расчетам, каждый МПКП соответствует выбросу кванта медиатора, состоящего из 10 000–40 000 молекул АцХ, и при этом активируется около 2000 постсинаптических каналов. Примерно в это же время (50–е годы) методами электронной микроскопии в пресинаптических окончаниях были обнаружены пузырьки (разд. 6.6.1) – структуры, в которых могли содержаться кванты медиатора. Тем самым квантовая теория выделения медиаторов получила морфологическое обоснование. Это позволило сформулировать представление о том, что выброс медиатора, содержащегося в пресинаптических пузырьках, путем экзоцитоза (рис. 6–32) вызывает как МПКП (при экзоцитозе одиночных пузырьков), так и обычный ПКП (выброс содержимого многих пузырьков). Сегодня получено множество разнообразных данных в пользу такой точки зрения. Так, измерение емкости мембраны показало, что при экзоцитозе она увеличивается, поскольку в результате слияния пузырьков с мембраной ее площадь возрастает.

 

Рис. 6.32. Экзоцитоз синаптических пузырьков с медиатором. Пузырьки сливаются с плазматической мембраной и выбрасывают свое содержимое в синаптическую щель. Медиатор диффундирует к постсинаптической мембране и связывается с расположенными на ней рецепторами. (Eccles, 1965.)

 

 

Квантовое выделение медиатора в двигательной концевой пластинке лягушки было подвергнуто тщательному статистическому анализу. При этом оказалось, что лишь определенная часть из всего количества пузырьков, содержащихся в нервном окончании, может непосредственно опорожняться в ответ на поступление в это окончание ПД. При определенных физиологических условиях (концентрации Са²⁺ и Mg²⁺, температуре и т.д.) существует некая вероятность того, что какой–либо из этих «готовых» пузырьков выбросит свое содержимое в синаптическую щель. При снижении концентрации Са²⁺ во внеклеточной среде этот ион поступает в волокно в меньшем количестве и вероятность опорожнения пузырьков падает. Если эта вероятность будет достаточно низкой, возникнет ситуация, приведенная на рис. 6–31: раздражение пресинаптического волокна будет сопровождаться множественными «выпадениями» (т. е. пузырьки не будут опорожняться вовсе) или выбросом содержимого лишь одного, двух или нескольких пузырьков. При этом возникнут ПКП, амплитуды которых будут соответствовать величине одного, двух, трех и т.д. МПКП. Таким образом, уменьшая концентрацию Са²⁺ во внеклеточной среде, можно добиться того, что на одиночный ПД будет выделяться не 200–300 квантов, как в норме, а 0, 1, 2, 3 и т. д. При этом можно будет рассчитать, какое количество пузырьков опорожняется в ответ на одиночный стимул, подать большое количество таких стимулов и произвести статистический анализ полученных данных. В результате такого анализа было показано, что вероятность опорожнения пузырьков подчиняется типичному для случайных событий пуассоновскому распределению (рис. 6–31).