3.8.1. Электронпереносящие коферменты

 

Электроны вместе с протонами (т. е. атомы водорода) отщепляются от молекул субстрата в ходе определенных метаболических реакций при помощи ферментов, которые имеют собирательное название дегидрогеназы. Все эти ферменты функционируют только при участии пиридиновых или флавиновых коферментов. Самые распространенные среди них – уже упоминавшийся никотинамидадениндинуклеотид (NAD⁺) и флавинадениндинуклеотид (FAD). Их структурные формулы приведены на рис. 3–33.

 

Рис.3.33. Структура флавинадениндинуклеотида (А) и никотшшмидадениндинуклеотида (Б). (Lehninger, 1975.)

 

В восстановленной форме эти коферменты служат акцепторами электронов, а в окисленной – донорами:

 

Восстановленный субстрат + NAD⁺    NADH + Н⁺ + Окисленный субстрат.

 

Весьма удобным обстоятельством для изучения реакций с участием этих коферментов является то, что спектры поглощения в ультрафиолетовой области у восстановленной и окисленной форм отличаются друг от друга (рис. 3–34). При переходе из окисленной формы в восстановленную и наоборот происходит также изменение их спектров флуоресценции при возбуждении в ультрафиолетовой области. Эти две особенности позволяют физиологам и биохимикам применять спектрофотометрические методы для наблюдения за концентрацией восстановленного кофермента в живых клетках в условиях эксперимента.

 

Рис. 3.34. Спектры поглощения NAD+ и NADH. Поскольку     используется для наблюдения за процессом восстановления разность коэффициентов поглощений для этих двух форм максимальна при 340 нм, именно эта длина волны обычно используется для наблюдения за процессом восстановления  NAD+ в NADH. (Lehninger,1975)

 

Рис. 3.35. Окисление NADH приводит к высвобождению химической энергии (ΔG0 = –52 ккал/молъ).

 

 

Энергетический уровень восстановленной молекулы кофермента, NADH или FADH₂, гораздо выше, чем энергетический уровень кислорода. В результате перенос пары электронов с NADH на О₂ сопровождается изменением свободной энергии на величину порядка — 52 ккал/моль (рис. 3–35). Эта энергия составляет значительную часть в общем балансе свободной энергии в 686 ккал, возникающем при окислении глюкозы, так как из 1 моля глюкозы получается 10 молей восстановленного NAD и 2 моля восстановленного FAD. Умножив 12 на 52, получим в итоге 624 ккал. Таким образом, 91% энергии окисления глюкозы передается электронпереносящим коферментам и расходуется на последних этапах переноса электронов. Как мы уже отмечали, 266 ккал из этого количества аккумулируется в молекулах АТР.

 

3.9. Цепь переноса электронов

 

Замечательно, что, несмотря на большую разницу в электронном давлении между NADH и О₂, не существует ферментативного механизма прямого окисления NADH и FADH₂ кислородом. Вместо этого в процессе эволюции сформировалась сложная цепь переноса электронов, или дыхательная цепь, состоящая примерно из семи отдельных ступеней, по которым передаются электроны, – начиная с NADH или FADH₂ с их низким окислительно–восстановительным потенциалом и кончая молекулярным кислородом, конечным акцептором электронов. Эта цепь переноса электронов представляет собой общий для всех электронов конечный отрезок пути при аэробном метаболизме. Как мы увидим ниже, его роль заключается в эффективной утилизации энергии, высвобождаемой при переносе электронов, через реакцию фосфорилирования ADP с образованием АТР.

Цепь переноса электронов включает ряд сложных белков, называемых цитохромами, каждый из которых содержит гемогруппу – сильный хромофор. Основной компонент гемогруппы – макроцикл поpфирина с атомом железа в центре (рис. 3–36); эта группа подобна гемогруппе пигмента гемоглобина в эритроцитах позвоночных. Функциональная последовательность цитохромного ряда изображена схематически на рис. 3–37. Расположение молекул на этой диаграмме таково, что при движении слева направо у каждой следующей молекулы электронное давление ниже, чем у предыдущей. В результате электроны переносятся с NADH вниз по энергетической лестнице, состоящей из семи окислительно–восстановительных реакций; перенос заканчивается восстановлением молекулярного кислорода. Только последний компонент в этой цепочке –  цитохром  аа₃ (единственный из цитохромов, который является собственно ферментом) –способен переносить свои электроны непосредственно на кислород.

 

Рис. 3.36. Структура гема А, который является донорно–акцепторной группой цитохрома аа3. В центре порфиринового кольца находится атом железа, который окисляется или восстанавливается в процессе переноса электронов. (Lehninger, 1975.)

 

Рис. 3.37. Энергетическая лестница, по которой происходит перенос электронов в дыхательной цепи.

 

Как окисленные, так и восстановленные формы цитохромов имеют характерные спектры поглощения, причем последние поглощают сильнее в длинноволновой части спектра. Такие их свойства помогли Дейвиду Кейлину в 1925 г. впервые установить функцию цитохромов. Проводя спектрофотометрические измерения, он обнаружил, что летательные мышцы насекомых содержат какие–то соединения, которые окисляются и восстанавливаются в процессе дыхания. Он назвал эти соединения цитохромами и предположил, что они переносят электроны с высокоэнергетических субстратов на кислород. Когда конечный этап дыхательной цепи – перенос электронов цитохромоксидазой (состоящей из субъединиц а и а₃) на О₂– блокируется цианидом, наблюдается тот же эффект, что и по прекращении поступления молекулярного кислорода. Электроны «накапливаются» выше места блокировки, поскольку перекрывается сквозной транспорт вдоль цепи, и восстанавливают все молекулы цитохромов до точки блокировки. Другой дыхательный яд – антимицин – перекрывает поток электронов на пути от цитохрома b к цитохрому с (рис. 3–38), в результате чего все цитохромы, расположенные выше точки блокировки, восстанавливаются, а все цитохромы ниже этой точки окисляются. Такое избирательное ингибирование в разных точках дыхательной цепи помогло биохимикам установить последовательность переноса электронов с помощью спектрофотометрических методов, позволяющих следить за окислением и восстановлением цитохромов.

 

Рис. 3.38. Цепь переноса электронов. Пунктирные стрелки показывают, в каких участках может произойти размыкание цепи под действием дыхательных ядов (ингибиторов). При переносе пары электронов вдоль всей цепи, начиная с NADH (NAD 2e¯), происходит фосфорилирование трех молекул ADP до ATР. Здесь FP–флавопротеин, Q–кофермент Q. Символы b, с, c1, а и а3 обозначают соответствующие цитохромы, которые, как видно из рисунка, при переносе двух электронов работают парами.

 

 

С помощью энергетической лестницы, по которой движутся электроны, т. е. благодаря высвобождению химической энергии относительно небольшими порциями, достигается значительный энергетический выигрыш по сравнению с гипотетическим непосредственным восстановлением кислорода с помощью NADH. «Логика» такой системы переноса электронов становится понятной, если вспомнить, что средняя величина энергии в биологическом энергетическом обмене невелика по сравнению с полным изменением свободной энергии при переносе электронов с NADH на кислород. Для синтеза АТР из ADP и неорганического фосфата требуется всего 7,3 ккал/моль, тогда как при гипотетическом одноэтапном окислении NADH, при котором синтезировалось бы не более одной молекулы АТР, высвобождается 52 ккал/моль. При таком механизме лишь 14% (7,3 ÷ 52) доступной химической энергии было бы запасено в форме АТР, остальная энергия рассеялась бы в виде тепла. Во избежание лишних потерь, большой энергетический скачок, который имел бы место при переносе электронов в реакции прямого окисления NADH кислородом, разбивается на несколько этапов, на которых энергия высвобождается более мелкими порциями. Таким образом, сложившаяся в клетке система переноса электронов представляет собой механизм, который позволяет высвобождать энергию порциями, как раз достаточными для эффективного синтеза АТР. Как мы увидим далее, существуют три этапа переноса электронов в дыхательной  цепи, на которых изменение свободной энергии достаточно велико для активирования реакции фосфорилирования ADP с образованием АТР(рис. 3–38). Собственно реакция синтеза АТР из ADP и неорганического фосфата, сопряженная с отдельными этапами переноса электронов, называется окислительным фосфорилированием или фосфорилированием в дыхательной цепи. Фосфорилирование ADP до АТР происходит в результате переноса электронов 1) с флавопротеина на кофермент Q; 2) с цитохрома b на цитохромы с и с₁; 3) с цитохромов аа₃ (цитохромоксидаза) на молекулярный кислород. Таким образом, на каждую пару электронов, перенесенных вдоль всей цепи, синтезируются три молекулы АТР из трех молекул ADP и трех молекул неорганического фосфата (Р_i). Каждая пара электронов в конце пути восстанавливает половину молекулы О₂ с образованием одной молекулы воды:

 

2e¯ + 2Н⁺  + ½ O₂  H₂O

 

Сравнивая количество поглощенного кислорода (т.е. превращенного в воду) с количеством поглощенного неорганического фосфата (т.е. включенного в состав АТР), мы можем определить коэффициент окислительного фосфорилирования Р/О (отношение количества неорганического фосфата к количеству атомарного кислорода). Например, в случае, когда окислительное фосфорилирование происходит на каждом из трех этапов, упомянутых выше, на синтез АТР будет израсходовано 3 моля неорганического фосфата на каждый моль атомов кислорода  ½ O₂ , который будет включен в состав Н₂О. Следовательно, здесь Р/О = 3. Некоторые переносчики электронов, однако, минуют первый этап, на котором происходит фосфорилирование, восстанавливая сразу кофермент Q; в этом случае при переносе электронов возможны лишь две реакции фосфорилирования ADP до АТР на пару электронов, т.е. Р/О = 2.

Чтобы объяснить, каким образом происходит сопряжение синтеза АТР на молекулярном уровне с высвобождением свободной энергии в процессе переноса электронов, было предложено несколько моделей, которые сводятся к трем основным. Наиболее убедительной в настоящее время считается хемиосмотическая теория преобразования энергии, которую мы обсудим в разд. 4.7. Здесь стоит отметить, что когда митохондриальная мембрана почему–либо начинает «протекать», происходит разобщение окислительного фосфорилирования и цепи переноса электронов. Если происходит разрыв мембраны или если применяется какой–нибудь химический агент, повышающий ее проницаемость для Н⁺ и других катионов, синтез АТР уменьшается или вовсе прекращается; при этом и перенос электронов, и восстановление О₂ до Н₂О продолжаются по–прежнему, но вся высвобождаемая энергия выделяется в виде тепла. Разобщение окислительного фосфорилирования и цепи переноса электронов наблюдается также при воздействии некоторых лекарственных средств, например динитрофенола (ДНФ). Поскольку это вещество понижает эффективность энергетического обмена, одно время врачи прописывали его своим пациентам, чтобы помочь им избавиться от лишнего веса. Однако от его применения в качестве средства против ожирения пришлосьотказаться, поскольку выяснилось, что он вызывает патологические побочные эффекты.