4.10.2. Плотные контакты

 

В области плотных контактов плазматические мембраны соседних клеток непосредственно контактируют друг с другом (рис. 4–39, В), так что между ними не остается никакого зазора, заполненного межклеточной жидкостью. Плотные контакты образуются в основном между эпителиальными клетками и представлены несколькими типами. Zonula occludens опоясывает каждую клетку и ограничивает межклеточный перенос веществ с одной стороны эпителия на другую. В некоторых тканях области этих контактов не являются непрерывными и контакты на самом деле оказываются не совсем плотными. Это характерно для эпителия тонкого кишечника, желчного пузыря и проксимальных канальцев нефрона млекопитающих. В этих тканях обнаруживается столь ощутимая межклеточная утечка, что в них не образуется трансэпителиальной разности потенциалов, даже когда составляющие их клетки имеют ионные насосы, порождающие трансэпителиальные ионные потоки (разд. 4.11). В противоположность щелевым контактам плотные контакты, по–видимому, не обладают специальными каналами, обеспечивающими прямую связь между клетками.

 

Рис. 4.42. Схематическое представление межклеточных контактов между соседними эпителиальными клетками (например, клетками, выстилающими тонкий кишечник млекопитающих). Мембраны и ассоциированные с ними структуры изображены непропорционально большими. (Weinstein, McNutt, 1972.)

 

 

На рис. 4–42 показаны и два других типа клеточных контактов –zonula adherens и macula adherens (последний чаще называют десмосомой). Эти контакты обеспечивают прежде всего структурную связь между соседними клетками.

 

 

4.11. Эпителиальный транспорт

 

Эпителиальные ткани образуют барьеры между различными компартментами организма животного, а также поверхности, граничащие с внешней средой. Такой слой поверхностных клеток имеется у каждого органа или компартмента. Некоторые из этих слоев являются лишь пассивным барьером между компартментами и не осуществляют транспорта растворенных веществ или воды. Однако эпителий может быть вовлечен и в активный транспорт, выполняющий регуляторные функции. Так, осморегуляторная активность многих специализированных тканей и органов животных осуществляется при участии эпителия, эффективно транспортирующего различные вещества (см. гл. 12).

Все эпителиальные ткани обладают рядом общих особенностей. Во–первых, они образуют поверхности, отделяющие внутреннее пространство организма от внешней среды. Такая локализация не всегда очевидна, потому что внешнее пространство может проникать далеко в глубь тела весьма сложным образом (в качестве примера можно привести просвет кишечника). Во–вторых, клетки, образующие наружный слой эпителия, обычно соединены с помощью плотных контактов, которые в разной степени в разных эпителиальных тканях ограничивают межклеточный перенос веществ между серозной (внутренней) и мукозной (наружной) сторонами эпителия (рис. 4–43). В некоторых типах эпителия, например в эндотелии стенок капилляров, контакты имеют утечку, поэтому вода и растворенные в ней вещества могут диффундировать по межклеточным путям.

 

Рис. 4.43. Эпителиальный транспорт, осуществляемый двумя путями – межклеточным и клеточным. Активный транспорт осуществляется только через клеточную мембрану, т. е. клеточным путем.

 

Поскольку подобная диффузия не сопряжена с каким–либо энергозависимым транспортным механизмом, она может быть только пассивной. Вещества, транспортируемые через эпителий с помощью активных механизмов, перемещаются по клеточным путям при участии клеточной мембраны. Они должны пересечь клеточную мембрану дважды – входя в клетку с одной стороны и выходя с другой. Как мы увидим в следующем разделе, функциональные свойства поверхностной мембраны эпителиальной клетки на серозной и мукозной поверхностях не совсем одинаковы и эта асимметрия очень важна для эпителиального активного транспорта.

 

 

 

4.11.1. Активный транспорт солей через эпителий

 

 

Энергозависимый перенос ионов с одной стороны эпителия на другую характерен для многих эпителиальных тканей, включая кожу и мочевой пузырь амфибий, жабры рыб и водных беспозвоночных, почечные канальцы и желчный пузырь позвоночных. Многие первые работы по изучению активного эпителиального транспорта были выполнены на препаратах кожи лягушки. У амфибий кожа является основным осморегулирующим органом. Соли активно транспортируются с мукозной ее стороны (т. е. стороны, обращенной наружу) к серозной, чтобы компенсировать утечку солей через кожу в пресную воду. Аналогичный транспорт происходит в кишечнике. Вода, которая поступает через кожу под действием осмотического градиента между гипотонической окружающей водной средой и жидкостями тела лягушки, выводится в составе мочи, сильно разбавленной по отношению к жидкостям тела.

Методика эксперимента по изучению эпителиального транспорта на препаратах кожи лягушки была разработана в 30–40–х годах немецким физиологом Эрнстом Хафом и датским физиологом Хансом Уссингом. Из брюшка наркотизированной и обезглавленной лягушки вырезали кусочек кожи площадью в несколько квадратных сантиметров и помещали в камеру Уссинга, как это показано на рис. 4–44. Получить такой препарат не составляет труда, поскольку кожа у лягушки в основном не прикреплена к лежащим под ней тканям и в пространстве между ними находится лимфа. Участок кожи осторожно зажимали между двумя отсеками камеры и наливали в них раствор, например раствор Рингера для лягушки (табл. 4–3). Отсек, прилегающий к мукозной стороне кожи, можно считать наружным компартментом, а отсек, обращенный к серозной стороне, – внутренним. Через отсеки продували воздух, чтобы оба раствора были насыщены кислородом.

 

Рис. 4.44. Ячейка Уссинга. Два отсека ячейки разделены кусочком кожи лягушки. В каждый из отсеков залит раствор Рингера или другой тест–раствор. С помощью источника тока разность потенциалов на колее лягушки доводят до нуля. В этих условиях ток, текущий через цепь (и соответственно через кожу), эквивалентен скорости переноса зарядов при активном транспорте ионов натрия через кожу.

 

Т а б л и ц а 4–3. Физиологические солевые растворы для различных организмов (концентрация указана в миллимолях на 1 л) (Prosser, 1973)

	NaCl	KCl	CaCl	MgCl2	NaHCO3	Другие компоненты
Морские животные
Омар	455	13,5	16,5	4,0	4,0	БуферH3BO3+NaOH
Кальмар	475	10,3	10,6	53,1	25,7	Фосфатный буфер, до pH 7,6
Акула	224	1,35	1,8	1,1	2,38	Глюкоза,15, Мочевина, 333
Искусственная морская вода	470	10,0	10,0	25,0	2,0
Пресноводные животные
Пиявка	115	4	1,8			Глюкоза,10
						Трис–буфер,10
Рак	207	5,4	13,6	2,64	2,4
Пресноводная рыба	101,8	3,38	1,36		2,5	MgSO4, 1,19
Лягушка	112	1,9	1,1		2,4	Глюкоза,11,1NaH2PO4, 0,7
Искусственная прудовая вода	0,5	0,05	0,4		0,2
Сухопутные животные
Таракан	210	3,1	1,8			Фосфатный буфер, до pH 7,2
Ящерица	116	3,2	1,2		2,0	NaH2PO4,0,3
						Глюкоза,1,7
						MgSO4,1,4
Птицы	117	2,23	5,8		28	MgSO4,2,12
Млекопитающие
Раствор Тироде	138	2,7	1,84	1,006	11,9	NaH2PO4, 0,5
Раствор Кребса	119	5,0	2,5	1,0	2,5	NaH2PO4, 0,5
						Глюкоза,11,0

 

 

В 1947 г. Уссинг сообщил о результатах первых экспериментов, в которых для измерения двунаправленных потоков (т. е. одновременного перемещения ионов через эпителий в противоположных направлениях) он использовал два изотопа одного иона. Раствор Рингера в наружном отсеке содержал изотоп натрия, ²²Na⁺ , а во внутреннем – другой изотоп, ²⁴Na⁺. В этом эксперименте Уссинг следил за появлением каждого из изотопов в противоположном отсеке. Были поставлены также опыты, в которых изотопы меняли местами, чтобы выявить возможное (но маловероятное) различие в скорости переноса из–за различия между изотопами. Все эксперименты показали, что существует результирующий поток Na⁺ через кожу из наружного отсека во внутренний, т. е. в этом направлении перемещается большее число ионов, чем в противоположном. Перечислим те данные, которые позволяют заключить, что суммарный перенос натрия осуществляется путем активного транспорта.

1. Перемещение натрия происходит в отсутствие концентрационного градиента и даже против электрохимического градиента.

2. Перемещение натрия подавляется основными метаболическими ингибиторами (например, цианидом и йодацетатом), а также специфическими ингибиторами транспорта (например, уабаином).

3. Транспорт Na⁺ сильно зависит от температуры.

4. Для транспорта натрия характерна кинетика с насыщением.

5. Транспорт натрия обнаруживает химическую специфичность. Например, ион лития, весьма сходный с Na ⁺ , не транспортируется.

Первые эксперименты Уссинга поставили ряд важных вопросов. Например, сопровождается ли направленный внутрь транспорт Na⁺ котранспортом аниона? Если нет, то он должен приводить к появлению электрического потенциала на коже из–за переноса положительного заряда, а Cl¯ в таком случае должен перемещаться пассивно под действием этого потенциала, уменьшая его. Наиболее важный вопрос – как происходит транспорт через слой клеток?

В 1951 г. Уссинг и Зеран сообщили о взаимосвязи между электрическим потенциалом и активным транспортом натрия. Они рассуждали следующим образом. Если через эпителий активно транспортируется один Na⁺, то должно наблюдаться количественное соответствие между числом переносимых ионов натрия на единицу площади кожи в секунду и силой результирующего тока (т. е. числом зарядов, пересекающих мембрану в секунду). В обычных условиях это соотношение едва ли выполняется, поскольку измеряемый ток может быть занижен из–за пассивного перемещения Cl¯ или других ионов, которые могут диффундировать через кожу по градиенту потенциала, образующегося из–за активного транспорта Na⁺. Это означает, что как только во внутреннем компартменте появляется несколько избыточных катионов, соответствующая сторона мембраны становится более положительной и Cl¯, например, перемещается через мембрану под действием электростатических сил. Чтобы исключить возможное влияние на электрохимический потенциал, Уссинг и Зеран для предотвращения накопления зарядов удаляли положительные заряды через внешнюю электрическую цепь по мере того, как катионы пересекали кожу (рис. 4–44). Уменьшение до нуля разности потенциалов приводит к двум важным последствиям. Во–первых, перемещение Na⁺не подавляется создаваемым им потенциалом, который противодействовал бы суммарному потоку Na⁺ при активном транспорте. Во–вторых, силу тока во внешней цепи (равную силе тока, текущего через кожу) можно сопоставить с общим числом ионов натрия, транспортируемых через кожу. При наличии количественного соответствия между силой тока и суммарным потоком натрия, измеряемым изотопными методами, подход, основанный на регистрации тока, можно использовать для определения транспорта Na⁺.

Уссинг и Зеран действительно обнаружили хорошее соответствие между этими величинами (рис. 4–45). И сила тока, и транспорт Na⁺ уменьшались или становились равными нулю при добавлении уабаина (блокирующего натриевый насос) и метаболических ядов или при выведении из наружного компартмента натрия.

 

Эти данные свидетельствуют о том, что активный транспорт натрия, по–видимому, является преобладающим по отношению к активному транспорту любого другого иона.

 

Рис. 4.45. Соответствие между током, текущим через кожу лягушки, и суммарным потоком натрия на единицу площади кожи. Тот факт, что сила тока (Кл/с) очень близка к потоку (г–экв/с)  (при пересчете следует использовать константу Фарадея, равную 96000 Кл/г–экв), говорит о том, что практически весь ток через кожу лягушки обусловлен переносом натрия. (Ussing, 1954.)

 

 

 

При отключении внешнего компенсирующего тока на коже лягушки в результате активного транспорта Na⁺ на серозную сторону быстро создается разность потенциалов. Это в свою очередь приводит к пассивному перемещению во внутренний компартмент Cl¯ по электрохимическому градиенту. Таким образом, сам по себе активный транспорт Na⁺ создает условия для суммарного переноса NaCl внутрь в том случае, когда препарат кожи погружен в раствор Рингера для лягушки. Однако в условиях, более близких к естественным (т. е. когда наружная поверхность кожи обращена в раствор, близкий по своему составу к прудовой воде), утечка Cl¯ через кожу отсутствует. При концентрации Na⁺ во внешней среде менее 3–10 мМ хлорид–ион активно переносится транспортной системой, не зависящей от транспорта натрия. Поглощение Cl¯ происходит в обмен на HCO₃¯ и, таким образом, не приводит к генерации электрического потенциала. Следовательно, лягушка, обитающая в пруду, активно поглощает и Na⁺, и Cl¯, чтобы пополнить запасы солей, выводимых во внешнюю среду.

Вернемся теперь к вопросу о том, как осуществляется активный транспорт ионов через эпителий. Вспомним (рис. 4–43), что соседние клетки эпителия тесно примыкают друг к другу и соединяются с помощью плотных контактов. Допустим для простоты, что это исключает все экстраклеточные пути диффузии ионов между двумя сторонами эпителия (на самом деле существует незначительный поток между клетками). Если это так, то все вещества, проникающие через эпителий, должны пересекать мембрану эпителиальной клетки дважды – сначала входя в клетку с одной стороны, а затем покидая ее с противоположной стороны. Для реализации активного транспорта в этом случае необходимо, чтобы та часть клеточной мембраны, которая обращена к серозной стороне эпителия, отличалась в функциональном отношении от части, обращенной к мукозной стороне. Эксперименты, проведенные на препаратах кожи лягушки, подтвердили справедливость этой гипотезы.

1. Уабаин, который блокирует работу Na⁺–K⁺–насоса, подавляет трансэпителиальный транспорт натрия только в том случае, когда он находится с внутренней (серозной) стороны эпителия, но не с внешней (мукозной). Напротив, такое соединение, как амилорид, мощный ингибитор пассивного опосредованного переносчиком транспорта, блокирует перемещение натрия через кожу лягушки, только находясь с внешней стороны.

2. Чтобы происходил активный транспорт натрия, калий должен находиться в наружном растворе; присутствие его во внутреннем компартменте несущественно.

3. Для транспорта натрия характерна кинетика с насыщением; при этом скорость транспорта зависит от концентрации Na⁺ снаружи, но не внутри.

Эти данные послужили основой для построения модели эпителиального транспорта натрия, представленной на рис. 4–46. Согласно этой модели, Na⁺ –K ⁺ –нacoc, осуществляющий обмен, а также Na⁺– H⁺– и Na⁺ –NH₄⁺– насосы в интактном эпителии расположены в мембране с серозной стороны эпителиальной клетки. Эта мембрана ведет себя аналогично многим другим клеточным мембранам, выкачивая Na⁺ в обмен на К⁺ и таким образом поддерживая высокую внутриклеточную концентрацию калия и низкую –натрия. Благодаря направленной наружу диффузии ионов калия через мембрану с серозной стороны клетки на мембране создается потенциал покоя, отрицательный внутри.

 

Рис. 4.46. Модель трансэпителиального транспорта натрия в изолированном препарате кожи лягушки, погруженном в раствор Рингера. Na + пассивно диффундирует в клетку по концентрационному градиенту с мукозной стороны, а К+ –из клетки с серозной стороны по мере поступления Na+. Na +–К +–обменный насос, встроенный в клеточную мембрану с серозной стороны, поддерживает высокую внутриклеточную концентрацию К+ и низкую –Nа +. (Koefoed–Johnsen, Ussing, 1958.)

 

 

 

Совершенно иная ситуация имеет место на мукозной стороне. Клеточная мембрана здесь слабо проницаема для калия. Более того, суммарная направленная внутрь диффузия ионов натрия через мембрану (по–видимому, облегчаемая переносчиками или происходящая через каналы в мембране) возмещает утрату Na ⁺ , выводимого с серозной стороны. Эта модель объясняет, почему агенты, блокирующие натриевый насос, эффективны только тогда, когда находятся с серозной стороны эпителия, и почему только изменения концентрации К⁺ с этой стороны влияют на скорость транспорта натрия.

Таким образом, суммарный перенос Na⁺ через кожу лягушки с мукозной стороны на серозную обусловлен функциональной асимметрией мембраны. Никакой другой движущей силы, кроме активного транспорта Na⁺, свойственного клеточным мембранам всех тканей, здесь нет.

Кожа лягушки служит модельной системой для изучения общих особенностей эпителиального транспорта солей. Детали этого процесса могут зависеть от типов эпителиальной ткани, но основные его особенности, которые мы отметим ниже, вероятно, свойственны всем эпителиальным тканям, через которые осуществляется транспорт веществ.

1. Плотные контакты блокируют перенос веществ между клетками, поэтому он осуществляется в основном через эпителиальные клетки.

2. Мукозная  и серозная стороны  клеточных мембран функционально различаются; это касается характера активности ионных насосов и мембранной проницаемости.

3. Активный транспорт катионов через эпителий обычно сопровождается транспортом (пассивным или активным) анионов в том же направлении или обменом на другую разновидность катиона, что приводит к минимизации электрического потенциала. Для активного транспорта анионов наблюдается обратная картина.

4. Эпителиальный транспорт не ограничивается поглощением ионов натрия и хлора. Известно, что различные эпителиальные ткани транспортируют Н⁺, НСО₃¯, К⁺ и другие ионы.