Применение низкотемпературной инкубации для селективного выделения дрожжей

Посев из образца лесной подстилки, инкубация 3 сут. при комнатной температуре	Посев из этого же образца, инкубация 14 сут. при 5°C

 

Учету и выделению дрожжей из природных субстратов методом посевасильно мешают мицелиальные грибы, присутствующие в изучаемом субстрате. Колонии грибов маскируют более мелкие дрожжевые колонии и затрудняют их изоляцию. Ограничить рост мицелиальных грибов химически невозможно: всеингибиторы ростамицелиальных грибов действуют и на дрожжи. Однако, при температуре около 5°С дрожжевые колонии в среднем развиваются быстрее. Кроме того, в почве, на растениях и растительных остатках значительную долю могут составлятьпсихрофильные дрожжи, не растущие при температуре выше 22-25°C. Поэтому при учете дрожжей в природных местообитаниях часто применяют метод низкотемпературной инкубации посевов.

Учет липомицетов методом обрастания почвенных комочков

Клетки липомицетовв почве прочно адсорбированы на поверхности почвенных агрегатов. Этому способствуют мощныекапсулы, состоящие изполисахаридовс карбоксильными группами, взаимодействующие с катионами. Поэтому клетки липомицетов с трудом переходят в водную суспензию, и даже после многократных отмываний почвенной навески они в основном остаются в осадке и, следовательно, не обнаруживаются при стандартном посеве из разведений.

Для обнаружения и учета численности липомицетов применяют метод почвенных комочков на среде Эшби (состав в г/л: сахароза - 20, K₂HPO₄- 0.2, KH₂PO₄- 0.1, MgSO₄- 0.2, NaCl - 0.2, K₂SO₄- 0.1, агар - 20, вода - 1 л.). После стерилизации среду подкисляют молочной кислотой до pH 4.0 для подавления роста бактерий, или добавляют антибактериальные антибиотики.

Навеску около 0.1 г почвы раскладывают в виде 50-100 мелких комочков на поверхности среды в чашке Петри. Инкубирование проводят при комнатной температуре в течение 2-3 нед. Для предотвращения высыхания среды чашки лучше инкубировать во влажной камере.

Липомицеты образуют характерные слизистые обрастания вокруг комочков. Метод является полуколичественным: численность липомицетов выражают относительным числом комочков со слизистыми обрастаниями (в процентах от общего количества комочков).

Из обрастаний почвенных комочков липомицеты можно выделить в чистую культуру. Для этого материал из обрастаний переносят петлей в чашку с подкисленной средой и рассевают истощающим штрихом. Отдельные колонии липомицетов пересевают в пробирки.

Метод отпечатков для исследования эпифитных дрожжей

Отпечатки листьев на поверхности сусло-агара, образованные выросшими колониями эпифитных дрожжей. Преобладающие черные колонии - Aureobasidium pullulans.

Простой способ изучения эпифитныхдрожжей - посев методом отпечатков листьев. Для этого лист прижимается на некоторое время к поверхности агаровой среды. Прилипшие к среде клетки дрожжей прорастают и после инкубации на чашке появляется изображение листа из выросших колоний. На фотографии видно, что наибольшее количество колоний расположено вдоль проводящих жилок листа, так как именно в районе жилок в основном происходитэкссудацияпитательных веществ.

Как правило, методом посева из суспензии измельченных листьев удается выявить большее разнообразие дрожжей, чем методом отпечатков, что говорит о том, что клетки эпифитных дрожжей могут быть плотно адсорбированына поверхности листьев, или даже расти внутри растительной ткани (эндофитные дрожжи). С другой стороны, при измельчении листьев могут высвобождаться фитонциды, ингибирующие рост дрожжей.