Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

Ізоформи пероксидази цукрових буряків і пшениці за бактеріального стресу

1КОЛОМІЄЦЬ Ю.В., 2БУЦЕНКО Л.М., 2ПАСІЧНИК Л.А.

1Національний аграрний університет, кафедра біотехнології та біорізноманіття вул. Героїв Оборони, 15, м. Київ, 03041, Україна

e-mail: julyja@i.ua

2Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, відділ фітопатогенних бактерій вул. Заболотного, 154, м. Київ МСП, Д 03680, Україна

е-mail: plant_path@ukr.net

Активація ферменту пероксидази у рослин є важливою ланкою сигнальної системи, яка передає еліситорний сигнал і індукує експресію захисних генів, PR-білків, інгібіторів протеїназ, активних форм кисню, які визначають захисну відповідь клітин на інфікування. Пероксидазні системи рослин перетворюють феноли в токсичні для фітопатогенів хінони, приймають участь в процесах лігніфікації. В багатьох роботах показано підвищення активності пероксидази при патогенезі. Крім підвищення активності у клітинах рослин формується унікальний стресовий набір ізопероксидаз.

Незважаючи на значні досягнення у вивченні комплексу рослина-патоген, остаточно не з'ясовано ролі ізоферментів пероксидази в захисті рослин від патогенних бактерій. Метою роботи є дослідження ізоферментного складу пероксидази пшениці та цукрових буряків за дії найбільш небезпечних збудників бактеріозів – патоварів Pseudomonas syringae.

Об'єктами досліджень були калюсні тканини цукрових буряків триплоїдних гібридів Лена, Каверось та пшениці сорту Рання 93. Калюсні лінії одержували на модифікованих середовищах Мурасіге-Скуга. В дослідах, які моделюють вплив стресового фактору, до середовища додавали 0,8% або 1,0% інактивованих клітин (ІК) патогенів: P. wieringae 7922,

P. syringae pv. atrofaciens 8281, P. syringae pv. сoronafaciens 9030, 8,0% або 10,0% ІК

P. syringae pv. aptata 8544. Розділення ізоферментів здійснювали в 7,5% поліакриламідному гелі з тріс-гліциновим буфером рН 8,3. Зони пероксидазної активності виявляли за реакцією між бензидином і аскорбіновою кислотою. Ізоферментний спектр характеризували за електрофоретичною рухливістю (Rf).

Додавання ІК в поживні середовища зумовлювало різке зниження життєздатності клітинних колоній. Так, за внесення 0,8% ІК P. wieringae 7922 приріст маси калюсу гібриду Каверось зменшився на 65%, Лена – на 74%. За концентрації 8 та 10% ІК P. syringae pv. aptata 8544 частка калюсів здатних до росту становила лише 11-19%. На середовищах з ІК

P. syringae pv. atrofaciens або P. syringae pv. сoronafaciens 10-14% колоній клітин пшениці сорту Рання 93 були життєздатними.

В калюсних тканинах триплоїдного гібриду Лена за культивавання на контрольних середовищах і середовищах з ІК P. syringae pv. aptata 8544, P. wieringae 7922 виявляється дві зони пероксидазної активності з Rf 0,09 і 0,45.

223

Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

У триплоїдного гібриду Каверось виявлено чотири ізоформи пероксидази з Rf 0,05; 0,1; 0,18; 0,27. За культивування калюсних тканин на середовищах з ІК спостерігали зміни у кількісному співвідношенні цих ізоформ пероксидази. В жодному випадку ми не спостерігали появи нових або повного зникнення існуючих ізоферментів.

В калюсних тканинах пшениці сорту Рання 93 як за наявності ІК P. syringae pv. atrofaciens 8281, P. syringae pv. сoronafaciens 9030, так і за відсутності ІК бактерій в середовищі, спостерігали лише одну ізоформу з Rf 0,06.

Таким чином, за умови бактеріального стресу спостерігається підвищення активності пероксидази, яке не супроводжується появою нових форм цього ферменту.

Робота виконана за фінансової підтримки державного фонду фундаментальних досліджень.

Вплив синтетичних препаратів адаптогенної дії на жирнокислотний склад плазматичних мембран з коренів проростків кукурудзи за умов засолення

КОНТУРСЬКА О.О.

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, відділ клітинної біології та анатомії рослин вул. Терещенківська, 2, м. Київ, 01601, Україна

е-mail: konturska@ukr.net

Засолення ґрунтів є одним із найбільш сильних абіотичних факторів, що скорочує світове виробництво сільськогосподарської продукції. Перспективи використання таких ґрунтів пов'язують з посиленням солестікойсті рослин. Це можливо зробити за допомогою створення трансгенних форм основних культур (Zhu, 2001). Поряд з цим існує можливість значного посилення толерантності до умов засолення шляхом застосування малотоксичних дешевих сполук з властивостями антидепресантів. Так, було встановлено, що обробка насіння кукурудзи препаратами Метіур та Івін (синтезовані в ІБОХ НАН України) запобігала гальмуванню росту проростків в присутності NaCl, а також послаблювала процеси пероксидного окиснення ліпідів в тканинах їх органів (Куриленко, 2001).

Однією з біохімічних відповідей на дію стресових факторів, зокрема засолення, є зміни жирнокислотного складу плазматичних мембран (Mansour, 2002). Нами було досліджено вплив препаратів Метіур та Івін на вміст жирних кислот плазматичної мембрани з коренів проростків кукурудзи при їх 1- та 10-добовій сольовій експозиції.

Проростки кукурудзи гібриду Колективний 225 МВ вирощували у водній культурі на поживному середовищі Хогленда при 24ºС. Обробку насіння Метіуром та Івіном здійснювали шляхом добового замочування в 10-7 М водних розчинах цих препаратів. Сольовий стрес створювали експонуванням 7-добових проростків на поживному середовищі

224

Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

в присутності 100 мМ NaCl. Склад жирних кислот визначали методом газо-рідинної хроматографії.

Було знайдено, що сольова експозиція знижувала вміст ненасичених жирних кислот (лінолевої та ліноленової) та підвищувала рівень ненасичених (стеаринової). Це спричинило зменшення співвідношення ненасич/насич. Експозиція проростків з насіння, що було оброблене Метіуром та Івіном, в присутності 0,1 М NaCl спричинила підвищення рівня ненасичених жирних кислот, особливо олеїнової. Також оброблення насіння Метіуром підвищило вміст жирних кислот з довгим карбоновим ланцюгом. Обробка зазначеними синтетичними препаратами збільшила співвідношення ненасич/насич.

Таким чином нами було встановлено залежність впливу обробки насіння препаратами Метіур та Івін на вміст жирних кислот в плазматичній мембрані.

ЛІТЕРАТУРА

1.Zhu J-K. Plant salt tolerance// Trends in Plant Science. – 2001. – 6, № 2. – P. 66-71.

2.Куриленко І.М., Палладіна Т.О. Вплив регуляторів росту на процеси пероксидного окислення у проростках кукурудзи за умов сольового стресу // Укр. біохім. журн. – 2001. –

73, № 6. – С. 56-60.

3.Mansour M.M.F., Salama K.H.A., Al-Mutawa M.M., Abou Hadid A.F. Effects of NaCl and polyamines on plasma membrane lipids of wheat roots // Biologia plantarum. – 2002. – № 45. – P. 235-239.

Оксид азоту опосередковує розвиток коренів Arabidopsis thaliana шляхом реорієнтації кортикальних мікротрубочок

КРАСИЛЕНКО Ю.А., ШЕРЕМЕТ Я.А., ЄМЕЦЬ А.І.

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, відділ геноміки та біотехнології вул. Заболотного 148, Київ, 03143, Україна

е-mail: kralia_bio@ukr.net, yarasheremet@univ.kiev.ua, alyemets@univ.kiev.ua

Оксид азоту (ІІ), NO, виступає вторинним посередником у сигнальних каскадах філогенетично віддалених видів. У рослин NO залучений до регуляції клітинного циклу, процесів диференціації та морфогенезу, а також сприяє адаптаційній пластичності рослин при інвазії патогенів та дії абіотичних факторів (Neill, Desikan, Hancock, 2003). Більшість зазначених процесів забезпечуються компонентами цитоскелету, зокрема, мікротрубочками (Cell …, 2006). Структурне різноманіття мікротрубочок рослин визначається наявністю ізотипів альфата бета-тубулінів та їх посттрансляційних модифікацій (Blume et al., 1997). Відомо, що альфа-тубулін є основною мішенню нітрування за тирозиновими залишками у клітинах тварин (Eiserich et al., 1999; Bisig et al., 2002). Наявність та функціональна роль нітротирозилювання тубулінів рослин залишаються нез'ясованими. Метою наших

225

Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

досліджень було вивчення впливу донора NO, нітропрусиду натрію, в діапазоні концентрацій 10, 100, 250 та 500 мкM протягом 3-72 г на орієнтацію та організацію сітки кортикальних мікротрубочок у клітинах коренів 4-денних рослин Arabidopsis thaliana, що експресують GFP-MAP4 in vivo. Обробка рослин нітропрусидом натрію протягом 24 г спричиняла посилення росту первинних коренів, формування кореневих волосків, а також бічних та додаткових коренів, проте триваліша обробка (48-72 г) призводила до значного сповільнення росту первинних коренів порівняно з контролем. Відзначено, що під впливом нітропрусиду натрію змінюються орієнтація та організація мікротрубочок у різних типах клітин певних функціональних зон кореня A. thaliana. Особливу сприйнятливість до дії донору NO виявили епідермальні клітини зони видовження, де вихідна поперечна орієнтація мікротрубочок змінювалась на невпорядковану, навскісну або повздовжню відносно основної вісі кореня. Припущено, що NO як одна з внутрішньоклітинних пускових молекул диференціації клітин може спричиняти реорієнтацію або реорганізацію сітки кортикальних мікротрубочок внаслідок нітротирозилювання тубуліну у присутності екзогенного донора NO.

ЛІТЕРАТУРА

1.Neill S.J., Desikan R., Hancock J.T. Nitric oxide signalling in plants // New Phytol. – 2003. – 159. – P.11-35.

2.Cell Biology and Instrumentation: UV Irradiation, Nitric Oxide and Cell Death in Plants. Eds. Y.B. BLume, D.J. Durzan and P. Smertenko // NАТО Life Science Series: Life and Behavioral Sciences. – 2006. – 371. – 372 pp.

3.Blume Y.B., Smertenko A., Ostapets N.N., Viklickỳ V., Draber P. Post-translational modifications of plant tubulin // Cell Biol. Int. – 1997. – 21. – P. 918-920.

4.Eiserich J., Estevez A.G., Bamberg T.V., Ye Y.Z.,Chumley P.H., Bechman J.S., Freeman B.A. Microtubule dysfunction by posttranslational nitrotyrosination of α-tubulin: A nitric oxide-dependent mechanism of cellular injury // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – 96. – P. 6365-6370.

5.Bisig C.G., Purro S.A., Contın M.A., Barra H.S., Arce C.A. Incorporation of 3- nitrotyrosine into the C-terminus of a-tubulin is reversible and not detrimental to dividing cells // Eur. J. Biochem. – 2002. – 269. – P. 5037-5045.

Культивування лікарських грибів Ganoderma lucidum (Curt.) P. Karst. та G. applanatum (Pers.) Pat. в глибинній культурі

KРУПОДЬОРОВА Т.А.

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, відділ мікології вул. Терещенківська, 2, м. Київ, 01601, Україна

е-mail: krupoderova@yahoo.de

Можливість використання вищих базидіальних грибів у якості біологічно-активних об'єктів з широким спектром загальної та (чи) специфічної дії підтверджено результами багаточислених досліджень грибів в культурі (Даниляк, Решетников,1996; Wasser, 1999;

226

Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

Белова, 2004; Горовой, 2004). Для збільшення ефективності виробництва таких біологічно активних речовин необхідне отримання значної кількості кінцевого продукту, зокрема біомаси, при мінімальних витратах. У зв'язку з цим скринінг штамів лікарських грибів з роду Ganoderma та пошук недорогих живильних середовищ залишаються актуальними.

Метою нашого дослідження є вивчення динаміки росту та біосинтезу екзополісахаридів G. lucidum та G.applanatum на рідких середовищах.

За результатами попередніх досліджень живильних потреб 27 штамів G. lucidum та 13 штамів G. applanatum з Колекції шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України відібрано штам G. lucidum 1621 та штам G. applanatum 1572, котрі добре ростуть на середовищах з крохмалем та лактозою. В якості досліджуваних середовищ використано молочну сироватку та відходи виробництва крохмалю (крупка, 20 г/л). Середовища інокулювали гомогенізованою біомасою певного штаму (10% за об'ємом) і вирощували на "качалці" при температурі26 ± 1ºС. Визначенняконцентраціїбіомаситаекзополісахаридівпроводиливдинаміці росту починаючи з третьої до 19 доби культивування. Екзополісахариди визначали в культуральній рідині (Babitskaya et all., 2000). Розрахунки біомаси та екзополісахаридів здійснено заабсолютносухоюречовиноюпіслявисушуванняпри105ºСдопостійноїваги.

Побудовано криві динаміки накопичення біомаси та екзополісахаридів G. lucidum на молочній сироватці і на крохмалевмісному середовищі. Порівняно з експериментами інших дослідників (Бабицкая и др., 2004), криві не співпадають. На молочній сироватці пік біосинтезу біомаси (29,6 г/л) відмічено на 5 добу, екзополісахаридів (10 г/л) – на 11 добу, на крохмалевмістному середовищі максимальна кількість біомаси (7 г/л) накопичувалась на 9 добу, екзополісахаридів (4,2 г/л) – на 15 добу. Пік синтезованої біомаси (17,2 г/л) та екзополісахаридів (9,1 г/л) G. applanatum при культивуванні на молочній сироватці виявлено на 11 добу. Максимальна кількість біомаси G. applanatum на крохмалевмістному середовищі становила 15,2 г/л на 11 добу культивування, найбільша ж кількість екзополісахаридів – 5,3 г/л на 13 добу. Одержані результати дозволяють рекомендувати штам G. lucidum 1621 для культивуваннянамолочнійсироватцівпромисловихмасштабах.

ЛІТЕРАТУРА

1.Бабицкая В.Г, Щерба В.В., Рожкова З.А. Пучкова Т.А., Кузьмина О.Н.

Кинетические параметры роста базидиальных грибов и биосинтеза полисахаридов: Матер. Междунар. конф. (26-28 мая 2004 г., Минск). – Минск: ГНУ Ин-т микробиологии НАН Беларуси, 2004. – С. 44-45.

2.Белова Н.В. Перспективы использования биологически активних соединений высших базидиомицетов в России // Микол. и фитопатол. – 2004. – 38, № 2. – С.1-3.

3.Горовой Л.Ф. Шляпочные грибы – перспективный источник лечебных препаратов и биологически активных добавок // Успехи медицинской микологии – М.: Национ. акад.

микол., 2004. – 3. – С. 212-215.

4.Даниляк М.І., Решетников С.В. Лікарські гриби. Медичне застосування та проблеми біотехнології. – К.: Ін-т ботан. ім. М.Г. Холодного НАН України, 1996. – 65 с.

5.Babitskaya V.G., Scherba V.V., Mitropolskaya N.Y., Bisko N.A. // Int. of Med. Mushrooms. – 2000. – 2. – P. 51-54.

227