Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

Вплив початкового значення кислотності поживного середовища на целюлозолітичну активність деяких вищих дереворуйнівних грибів

ДРЕВАЛЬ К.Г., БОЙКО С.М.

Донецький національний університет вул. Щорса, 46, м. Донецьк, 83050, Україна е-mail: konstantin-ua@ukr.net

Усучасних умовах недостатнього забезпечення України власними паливноенергетичними ресурсами деревина постає одним із найбільш доступних, економних та перспективних джерел відновлюваної енергії (Адаменко, Височанський, Льотко та ін., 2001).

Упроцесах біоконверсії целюлози етапом, що стримує впровадження технології у виробництво, є її ферментативний гідроліз до глюкози (Скомаровський та ін., 2006). Незважаючи на досягнення у вивченні целлюлаз, все ще не з'ясовано, які ферменти та в яких співвідношеннях необхідні для забезпечення ефективного гідролізу целюлози; є лише окремі робочі гіпотези відносно механізму дії целлюлаз (Семичаєвський, 1989).

Нашою метою було знайти високоефективні продуценти целлюлаз серед сапротрофних дереворуйнівних грибів, а завданням – встановити вплив початкового значення рН поживного середовища на активність целюлаз деяких вищих сапротрофних дереворуйнівних грибів.

Уякості об'єктів нами було обрано культури: K-1, I-6 Irpex lacteus Fr., та CS-1 Coriolus sinuosus Fr. Культивування проводили на середовищі Чапека (джерело вуглецю – тирса деревини абрикосу (Armeniaca)) при температурі 32°С. Визначення активності целюлаз проводили на 5, 10, 15 та 20 добу культивування. рН поживного середовища доводили до значення 6, 7 та 8 одиниць за допомогою 10% розчину HCl. Про активність ферментів целюлозолітичної дії (ЦА) судили за кількістю редукуючих цукрів у реакційній суміші, які визначали за Шомодьї-Нельсоном (субстрат – фільтрувальний папір). Отримані дані обробляли статистично методами дисперсійного аналізу. Порівняння середніх проводилося за методами Дункана та Данета.

Результати досліджень показали, що культура К-1 I. lacteus найбільш активно синтезує целюлозолітичні ферменти при початковому рН поживного середовища на рівні 7 одиниць. Максимум ЦА припадає на 10 та 15 доби культивування, значення між якими достовірно не відрізняються (0,89±0,05 мг/мл та 0,83±0,07 мг/мл відповідно). Найбільша ЦА у культури І-6 I. lacteus спостерігається при початковому рН поживного середовища на рівні 6 одиниць і виявляється на 15 добу культивування (0,83±0,04 мг/мл). Абсолютний максимум для культури CS-1 C. sinuosus зафіксовано при початковому рН поживного середовища на рівні 6 одиниць на 15 добу культивування (0,14±0,01 мг/мл).

Таким чином, було встановлено високу здатність культур К-1, І-6 I. lacteus синтезувати ферменти целюлозолітичної дії. Встановлено достовірність впливу початкового рН поживного середовища на целюлозолітичну активність цих культур. Було визначено, що

219

Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

культура CS-1 C. sinuosus не здатна активно синтезувати целюлозолітичні ферменти, що можна пояснити її біологічними особливостями.

ЛІТЕРАТУРА

1.Адаменко О., Височанський В., Льотко В. та ін. Альтернативні палива та інші нетрадиційні джерела енергії. – ІваноФранківськ: ІМЕ. – 428 с.

2.Семичаевский В.Д. Целлюлазы высших базидиальных грибов // Микология и фитопатология. – 1989. – 23, вып. 6.

3.Скомаровский А.А., Марков А.В., Гусаков А.В. и др. Новые целлюлазы для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы // Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. – 42, вып. 6. – С. 674-680.

Дослідження білкового складу Tn-5 мутантів Bradyrhizobium japonicum різної ефективності

1ДРОЗДЕНКО Г.М., 1КОЦЬ С.Я., 2ЗАЄЦЬ В.М.

1Інститут фізіології рослин і генетики НАН України вул. Васильківська, 31/17, м. Київ, 03022, Україна 2Інститут молекулярної біології і генетики НАН України вул. Заболотного, 150, м. Київ, 03143, Україна

е-mail: azot@ifrg.kiev.ua

Метод транспозонового мутагенезу є одним із ефективних інструментів отримання нових конкурентоспроможних і високоактивних штамів зі зміненими симбіотичними властивостями (Симаров, 1990). За яскраво вираженими ознаками ефективності симбіозу в результаті вегетаційних і польових досліджень зазвичай відбирається незначна частина активних мутантів, однак за об'ємом роботи і затратами часу ці дослідження є досить тривалими і трудомісткими.

Мета даної роботи полягала в дослідженні білкового складу Tn-5 мутантів із різними симбіотичними властивостями та ідентифікації протеїнів, які відповідають за ефективність симбіозу. Це у свою чергу полегшить і прискорить процес відбору активних і неактивних штамів бульбочкових бактерій сої ще в чистій культурі.

У результаті первинного скринінгу нових Tn-5 мутантів, проведеного на ранніх етапах розвитку симбіозу в умовах вегетаційних дослідів, було відібрано ряд Tn-5 мутантів із контрастними симбіотичними властивостями (Маліченко та ін., 2007). При дослідженні білкового складу в якості контролю використовували штам-стандарт 634б Bradyrhizobium japonicum, вихідний штам B. japonicum 646 і неактивний штам B. japonicum 604к. Культуру ризобій вирощували на манітно-дріжджовому середовищі протягом 8 днів при температурі 280С (Child., 1975). Кількісний і якісний склад білків досліджували за допомогою градієнтного електрофорезу в 12-20% поліакриламідному гелі, з використанням буферної

220

Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

системи Laemmly (Laemmly et al., 1970). Гелі аналізували за допомогою спеціальної програми Total Lab. 2.0.

При аналізі білкових екстрактів не було виявлено суттєвих відмінностей у складі білків штамів та Tn-5 мутантів B. japonicum з різними симбіотичними характеристиками. Порівняння спектроденситограм свідчить про сталість якісного складу протеїнів досліджуваних мікроорганізмів не залежало від їхньої симбіотичної ефективності. Разом із тим, спостерігались відмінності у кількісному складі білків. Так, активні Tn-5 мутанти B. japonicum містили більшу кількість білків із молекулярною масою 70 і 200 кДа, що також характерно і для активних штамів 634б і 646.

Таким чином показано, що білковий склад бульбочкових бактерій пов'язаний з їхньою активністю. Подальші дослідження з використанням більш широкого спектру Tn-5 мутантів зі зміненими симбіотичними характеристиками. Дозволять ідентифікувати протеїни, задіяні в процесах фіксації молекулярного азоту.

ЛІТЕРАТУРА

1.Маліченко С.М., Даценко В.К., Василюк В.М., Коць С.Я. Транспозоновий мутагенез

Bradyrhizobium japonicum // Физиология и биохимия культ. растений. – 2007. – 39, № 5. –

С. 409-418.

2.Симаров Б.В., Аронштам А.А., Новикова Н.И. Генетические основы селекции клубеньковых бактерий. – Л.: Агропромиздат., Ленингр. отд-ние. – 1990. – С. 38-39.

3.Child J.J. Nitrogen fixation by a Rhizobium sp. Association with nonleguminous plant cell cultures // Nature. – 1975. – 253. – P. 350-351.

4.Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage // Nature. – 1970. – 227. – P. 680-685.

Получение каллусной ткани Artemisia dracunculus L.

ИНЮТКИНА А.Г.

Институт эфиромасличных и лекарственных растений УААН ул. Киевская 150, г. Симферополь, 95493, АР Крым, Украина е-mail: artemisiadr@gmail.com

Известно, что клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro клеток и тканей высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный процесс создания новых генотипов при использовании таких методов как: сомаклональная изменчивость, мутагенез in vitro, клеточная селекция и др. Каллусная ткань, состоящая из генетически разнообразных клеток, представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для реализации этих методов (Шевелуха и др., 1998). Одним из важных

221

Фізіологія, клітиннабіологія… // Физиология, клеточнаябиология… // Physiology, cell biology …

этапов при разработке клеточных технологий является оптимизация условий культивирования для получения каллусной культуры in vitro.

Полынь эстрагон (Artemisia dracunculus L.) является перспективным эфиромасличным, пряноароматическим и лекарственным растением, которое широко используется в медицине, парфюмерно-косметической и пищевой промышленностях (Машанов и др., 1988). Поэтому актуальным является разработка методов культуры тканей для этого ценного эфиромасличного растения. Целью работы явилось изучение влияния состава питательной среды и типа экспланта на индукцию образования каллуса в культуре in vitro у полыни эстрагон.

Объектом исследований служили четыре коллекционных образца эстрагона (A. dracunculus L.), различающихся по морфологии и составу эфирного масла (Хараим и др., 2007). В качестве эксплантов использовали фрагменты стеблей, листьев и молодые соцветия (корзинки 0,3-0,5 см). Экспланты помещали на среду Мурасиге и Скуга, дополненную фитогормонами (2,4-Д, НУК, ИУК, кинетин, БАП) в различных комбинациях и концентрациях. Стерилизацию сред, материалов и работу в асептических условиях проводили по стандартным методикам (Калинин и др., 1980).

Показано, что при введении в культуру in vitro 3-х различных типов эксплантов индукция каллусогенеза отмечалась только при использовании фрагментов листьев и стеблей. Из молодых соцветий наблюдалось лишь единичное образование каллуса, не способного к дальнейшей пролиферации. Установлено, что на безгормональной среде и при добавлении кинетина (1,0 мг/л) из листовых и стеблевых эксплантов не происходило образования каллуса. При внесении в среду БАП частота каллусогенеза составила 6,7% из листового и 15,0% из стеблевого эксплантов. Добавление в состав среды ауксинов НУК, ИУК, 2,4-Д значительно увеличило изучаемые показатели. Так, при использовании 2,4-Д (1,0 мг/л) отмечалась высокая интенсивность пролиферации каллуса (2,3 балла из листа и 1,5 балла из стебля), но процент каллусогенеза был немного ниже, чем при использовании НУК. Наибольшая частота каллусогенеза (83,0%-85,9%) и интенсивность образования каллуса (до 2,5 баллов) были получены при совместном использовании в составе питательной среды ауксина НУК (1,0 мг/л) и цитокинина БАП (0,5 мг/л).

ЛИТЕРАТУРА

1.Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – К.: Наук. думка, 1980. – 488 с.

2.Машанов В.И., Андреева Н.Ф., Машанов Н.С., Логвиненко И.Е. Новые эфиромасличные культуры. Справ. изд. – Симферополь: Таврия, 1988. – 160 с.

3.Хараим Н.Н., Невкрытая Н.В., Кривда С.И. Анализ селекционной ценности коллекционных образцов полыни эстрагон (Artemisia dracunculus L.) // Наук. зап. Терноп.

пед. ун-ту. Сер. біол. – 2007. – № 3 (33). – С. 85-89.

4.Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. – М.: Высш. шк., 1998. – 416 с.

222