Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
МЕДИЧНА ГЕНЕТИКА.doc
Скачиваний:
1623
Добавлен:
23.02.2015
Размер:
2.22 Mб
Скачать

«Клініко-генеалогічний аналіз»

Складання родоводу

пробанд

сибси

легенда родоводу

рід

розпитування

аналіз медичної документації

огляд

додаткове обстеження родичів

родина

Намалювати родовід

Той, хто консультується

Отримання даних

Генеалогічний аналіз

Встановити спадкову ознаку/хворобу

Встановити тип успадкування:

  • аутосомно-домінантний

  • аутосомно-рецесивний

  • Х-зчеплене домінантний

  • Х-зчеплене рецесивний

  • голандричний

  • мітохондріальний

Зробити

прогноз

Цитогенетичний та молекулярно-цитогенетичний метод. Цитогенетичний аналіз дозволяє записувати діагноз спадкового захворювання у вигляді каріотипічної формули. Цитогенетичний метод (метод хромосомного аналізу) ґрунтується на мікроскопічному дослідженні структури і кількості хромосом. Він набув широкого застосування в 20-х роках XX ст., коли було отримано перші відомості про кількість хромосом у людини. У 30-х роках ідентифіковано перші 10 пар хромосом. У 1956 р. шведські вчені Дж.Тийо і А.Леван вперше довели, у людини 46, а не 48 хромосом (як у мавп).

Цитогенетичний метод використовують для: • вивчення каріотипів організмів;

• уточнення числа хромосомних наборів, кількості і морфології хромосом для діагностики хромосомних хвороб;

• складання карт хромосом;

• для вивчення геномного і хромосомного мутаційного процесу;

• вивчення хромосомного поліморфізму в людських популяція

Стандартні цитогенетичні методи: 1) ФТА - культивування лімфоцитів; 2) диференційне забарвлення хромосом – Q, G, R, С. 3) NOR - забарвлення ядерце-утворюючих ділянок акроцентричних хромосом.

Хромосомний набір людини містить велику кількість хромосом, основні відомості про які можна отримати при вивченні їх в метафазі мітозу і профазі - метафазі мейозу. Клітини людини для прямого хромосомного аналізу отримують шляхом біопсії кісткового мозку і гонад, або непрямим методом - шляхом культивування клітин периферичної крові (лімфоцити), коли отримують значну кількість метафаз. Непрямим методом досліджують також клітини амніотичної рідини або фібробласти, отримані при амніоцентезі або біопсії хоріона клітини абортусів, мертвонароджених та ін.

Останнім часом всі дослідження в цитогенетиці людини проводять із застосуванням методів диференційного забарвлення хромосом; розроблено нові методики забарвлення хромосом, які дозволяють відрізнити кожну хромосомну пару (диференціальне забарвлення хромосом). Існує декілька способів забарвлення: Q, G, С, R. У вирішенні питань діагностики хромосомних хвороб різні методи диференціального забарвлення застосовують у комбінації.

Завдяки диференціальному забарвленню хромосом можна виявити незначні хромосомні поломки: невеликі делеції, транслокації та ін.

Хромосомні зміни виявляють, досліджуючи каріотип пацієнта, у клітинах амніотичної рідини і в клітинах хоріону для діагностики хромосомних захворювань плода.

Одним із останніх сучасних методів уточнюючої цитогенетичної діагностики є молекулярно-цитогенетичний метод, який отримав назву гібридизація in situ. Роздільна здатність методу складає 5х104 п.о., тому він дозволяє досліджувати хромосомні сегменти довжиною від 5х10 (4) до 5х10 (6) п.о. Для хромосоми або її ділянки, що вивчається, синтезують комплементарну послідовність ДНК і приєднують до неї мітку. "Міткою” можуть бути різні речовини, зокрема радіоактивні і флуоресцентні (флуорохроми). "Помічену" послідовність ДНК називають зондом. Зонд "знаходить" комплементарну послідовність в хромосомному наборі і приєднується до неї. Потім надлишок видаляють і проводять визначення сигналу гібридизації.

Відома модифікація цього метода, - флуоресцентна гібридизація in situ (FISH). Для проведення FISH, зонди різняться не тільки специфічністю по довжині, але і за способом мічення. Метод використовують не тільки для визначення розташування гена, але і для розшифрування складних хромосомних перебудов (уточнення хромосомних фрагментів, виявлення хромосомного мозаїцизму, розташування місць розривів при транслокації та ін.).

Найбільш частіше проводять наступні цитогенетичні дослідження:

  • Дослідження хромосом у лімфоцитах периферичної крові на стадіях метафази і прометафази з використанням диференціального фарбування (G-, С-, R- і Q- методи)

  • Виявлення специфічного сайту ламкості X-хромосоми.

  • Визначення Y-хроматину в клітинах крові.

  • Визначення X-хроматину в клітинах слизової оболонки порожнини рота (половий хроматин).

Показаннями для проведення цитогенетичного аналізу є:

    1. Підозра на хромосомну хвороба по клінічній симптоматиці (для підтвердження діагнозу).

    2. Наявність у дитини множинних вроджених вад розвитку, що не відносяться до генних синдромів та батьки дітей з множинними вадами розвитку.

    3. Багаторазові (більше двох) спонтанні аборти, мертвонародження чи народження дітей з вродженими вадами розвитку.

    4. Порушення репродуктивної функції неясного генезу у жінок та чоловіків (первинная аменорея, безплідний шлюб тощо), аномалії статевого розвитку у чоловіків та жінок.

    5. Затримка розумового і фізичного розвитку дитини.

    6. Пренатальна діагностика (пізній репродуктивний вік, у зв'язку з наявністю транслокації у батьків, при народженні попередньої дитини з хромосомною хворобою).

    7. Підозра на синдроми, що характеризуються хромосомною нестабільністю (облік хромосомних аберацій).

    8. Лейкози (для диференціальної діагностики, оцінки ефективності лікування і прогнозу перебігу).

    9. Оцінка мутагенних впливів (радіаційних, хімічних).

Біохімічні методи. Відомо понад 1000 спадкових захворювань обумовлених дефектами обміну речовин. Згідно з класифікацією ВООЗ спадкові дефекти обміну речовин поділяються на порушення:

• амінокислотного обміну;

• вуглеводного обміну;

• ліпідного обміну;

• стероїдного обміну;

• пуринового і піримідинового обмінів;

• вітамінів;

• мінералів;

• аномалії обміну металів;

• обмін речовин в еритроцитах і порушення їх обміну та ін.

Для вивчення ферментативних порушень використовують методи ензимології. Важливе значення мають не тільки кількісні зміни активності фермента, але і якісні відмінності у функціонуванні нормального і зміненого фермента.

Застосування біохімічних досліджень показано при підозрі на всі спадкові хвороби обміну речовин (CХО) і інші форми з точно встановленим дефектом первинного генного продукту або ланки.

Біохімічні методи дозволяють виявити нестачу певних сполук або надлишок їх попередників, і перш за все хроматографічні методи (хроматографія на папері, іонообмінних смолах, в тонких шарах, газорідинна хроматографія, методи електрофорезу, імуноелектрофорезу та ін.).

Поєднання їх із навантажувальними пробами значно підвищує інформативність дослідження.

СХО біохімічно можуть бути діагностовані за допомогою:

• визначення структури аномального білка (структурних білків або ферментів, таких, як аномальні гемоглобіни, холінестераза та ін.).

• визначення проміжних продуктів обміну, які з'являються внаслідок генетичного блоку прямої реакції обміну. Це найбільш поширений метод діагностики різних ензимопатій.

Найбільш поширені біохімічні методи досліджень:

1. Діагностика порушень амінокислотного обміну. Для визначення змін обміну амінокислот досліджують кров або сечу пацієнта.

2. Діагностика глюкозурій. Відомо понад 15 дефектів обміну вуглеводів. При цьому порушується або синтез ферментів вуглеводного обміну, або транспорт вуглеводів в ниркових канальцях, або всмоктування їх в кишках.

Зазначені порушення діагностують настурними біохімічними тестами:

- скринінг-тести (СХО амінокислот та вуглеводів);

- напівкількісне визначення спектру вільних амінокислот у крові і сечі за допомогою тонкошарової хроматографії (порушення амінокислотного обміну);

- визначення активності галактозо-1-фосфат уриділтрансферази (галактоземія).

3. Діагностика лізосомних хвороб.

Ряд спадкових захворювань характеризуються появою в сечі мукополісахаридів. Їх виявляють пробою з ортотулоїдином або тонкошаровою хроматографією. Зразки матеріалу (кров, сеча) можна наносити на диски фільтрувального паперу і пересилати в центральні біохімічні лабораторії для проведення аналізу на:

- визначення вмісту загальних глікозаміногліканів (ГАГ) у сечі (ЦПХ-тест);

- фракціонування ГАГ за допомогою тонкошарової хроматографії (мукополісахаридози);

- визначення спектру олігосахаридів у сечі за допомогою тонкошарової хроматографії (олігосахаридози);

- визначення активності лізосомних ферментів у лейкоцитах і плазмі крові:

  • арилсульфатаза А (метахроматична лейкодистрофія)

  • арилсульфатаза В (синдром Марото-Ламі)

  • гексозамінідаза-А і –В (синдроми Тея-Сакса і Сандхоффа)

  • галактозідаза (синдром Фабрі)

  • галактозідаза (генералізований гангліозидоз)

  • глюкуронідаза (синдром Слая)

  • глюкозідаза (синдром Помпе)

  • глюкозідаза (синдром Гоше).

Показання до біохімічного генетичного дослідження:

  1. Затримка психічного розвитку і розумова відсталість; іноді в поєднанні з патологією інших органів і систем.

  2. Порушення поведінки, розгальмування або аутизм, алалія.

  3. Судорожний синдром, м'язова гіпо- або гіпертонія, порушення координації, летаргічний стан, гіпертермія.

  4. Зниження зору або сліпота, зниження слуху або глухота.

  5. Деформації кістяка, малорухомістьсть або гіпермобільність суглобів.

  6. Гіпо- або гіперпігментація, підвищена фоточутливість шкіри, жовтяниця, шкірні висипання, екзема.

  7. Гепато- та спленомегалія.

  8. Нестерпність окремих харчових продуктів і лікарських препаратів. Поява після їхнього прийому блювоти, діареї, зниження апетиту, жирного випорожнення, ознак гемолітичної анемії.

  9. Ознаки сечокислого діатезу, у т.ч. нирково-кам'яної хвороби в дитячому віці.

  10. Незвичайний колір і запах сечі, незвичайний запах тіла, дихання.

  11. Попрілості у дитини, летаргія, блювота тощо.

Обов'язкові лабораторні дослідження крові при підозрі на спадкові порушення обміну речовин з гострим початком:

  • Загальний аналіз крові

  • Гази крові

  • Бікарбонати

  • Електроліти

  • Сечовина

  • Глюкоза

  • Фосфор

  • Кальцій

  • Аміак

  • Аспартат і аланінамінотрансфераза

  • Лактат

  • Амінокислоти

Молекулярно–генетичні методи діагностики.

Специфічною ознакою спадкових хвороб є те, що їх причиною являються зміни ДНК. ДНК-діагностика, як технологія, яка направлена на виявлення причини хвороби, є більш адекватним, об’єктивним та інформативним методом у діагностиці спадкової патології.

ДНК залишається практично не змінною протягом життя організму, починаючи з моменту запліднення яйцеклітини, що дозволяє проводити дослідження на будь-якій стадії розвитку організму.

Молекулярно-генетичні методи - велика і різноманітна група методів, які призначені для виявлення ушкоджень у структурі ділянки ДНК (алеля, гена, регіону хромосоми) аж до розшифровки первинної послідовності основ.

В основі цих методів лежать генно-інженерні маніпуляції з ДНК і РНК. Вихідним етапом усіх молекулярно-генетичних методів є одержання зразків ДНК. Джерелом геномної ДНК можуть бути будь-які клітини з ядром. На практиці частіше використовують лейкоцити, хоріон, амниотичні клітини, культури фібробластів. Можливість проведення молекулярно-генетичного аналізу з невеликою кількістю біологічного матеріалу є методичною перевагою методів даної групи.

У багатьох випадках для успішної діагностики хвороби досить досліджувати невеликий фрагмент генома. Виділення таких фрагментів стало можливим завдяки відкриттю ферментів - рестриктаз, що розрізають молекулу ДНК на фрагменти в строго визначених місцях.

Застосування цих ферментів в експерименті дає можливість одержати відносно короткі фрагменти ДНК, у яких легко можна визначити послідовність нуклеотидів.

Таким чином, за допомогою ДНК-діагностики можливо розв’язати наступні питання:

  • підтвердження клінічного діагнозу чи диференційна діагностика у хворого;

  • пресимптоматична діагностика – коли клінічні ознаки хвороби з пізньою маніфестацією відсутні;

  • пренатальна діагностика по ДНК матеріалу від плоду (ворсини хоріону, клітини амніотичної рідини, кров плоду);

  • преімплантаційна діагностика по ДНК клітин що дробляться у яйцеклітині, яка була запліднена in vitro.

Для клінічних цілей використовують аналіз ДНК людини, РНК, хромосом, білків, ферментів чи метаболітів для виявлення пов’язанних із спадковою патологією генотипів, мутацій, фенотипів, чи каріотипів у клінічних цілях.

Розрізняють пряму і непряму ДНК-діагностику моногенних спадкових хвороб.

При прямій діагностиці предметом аналізу є мутації гена. У ДНК-діагностиці на теперішній час використовуються різноманітні прямі методи. Найбільше просто виявляються мутації, що змінюють довжину ампліфікованих фрагментів ДНК, що виявляються при электрофоретичному аналізі.

Для виявлення точкових мутацій, невеликих делецій і інверсій у досліджуваних генах використовують методи, за допомогою яких можна проаналізувати унікальну послідовність ДНК. Прикладом може служити метод секвенування - визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Будь-які типи мутацій можуть бути виявлені шляхом прямого секвенування мутантної ДНК. Для деяких генів, що мають невеликі розміри, цей метод з успіхом застосовується як основний метод сканування мутацій. Головна перевага прямих методів діагностики - майже 100 % ефективність.

Непряме виявлення мутацій застосовується в тих випадках, коли нуклеотидна послідовність гена ще не відома, але мається представлення про положення гена на генетичній карті. Непряма ДНК-діагностика зводиться до аналізу поліморфних генетичних маркерів у хворих і здорових членів родини.

Маркери повинні бути розташовані у тому хромосомному регіоні, де і ген хвороби. Такими маркерами можуть бути ділянки ДНК, що існують у популяції в декількох алельних варіантах. Відмінності можуть бути по складу нуклеотидів, по числу дінуклеотидніх повторів. На основі варіабельністі маркерних ділянок ДНК можна диференціювати материнське чи батьківське походження конкретного варіанта маркера, якій зчеплений з геном хвороби.

Завдяки аналізу поліморфних генетичних маркерів можна визначити і простежити в поколіннях хромосому, що несе патологічний ген. Технічні прийоми до непрямій діагностиці ті ж, що й у прямій діагностиці (одержання ДНК, єлектрофорез і інші). Головний недолік непрямих методів діагностики - обов'язкове попереднє вивчення генотипу як мінімум одного ураженого родича.

На теперішній час активно розробляються діагностичні методики та окремі компоненти тест-систем для ДНК- аналізу мутантних генів, що спричинюють розвиток найбільш поширених в Україні моногенних спадкових захворювань (муковісцидоз, фенілкетонурія, спінальна м'язова атрофія, м'язова дистрофія Дюшена, синдром ламкої Х-хромосоми, гемофілія А, хорея Гентінгтона, спадковий гемохроматоз, мотосенсорна нейропатія Шарко-Марі-Тута, макулодістрофія Штаргардта), спадкову схильність до поширеної патології (онкологічної, сердцево-судинної, ендокринної) та генетично обумовлені форми чоловічого (азооспермія, олігоспермія) і жіночого (передчасне виснаження яєчників) безпліддя.

Молекулярна діагностика можлива для наступних хвороб:

  • Атаксія Фрідрейха

  • Адреногенітальний синдром

  • Хвороба Вердніга-Гофмана

  • Хвороба Вільсона-Коновалова

  • Хвороба Гіршпрунга

  • ß-таласемія

  • Хвороба Леша-Ніхана

  • Хвороба Луї-Бар

  • Хвороба Віллебранда

  • Хвороба Хантера

  • Гемофілія А

  • Гемофілія В

  • Дефіцит СоА дегідрогенази

  • Дефіцит α-1 антитрипсину

  • Муковісцидоз

  • Міодистрофія Дюшена, Беккера

  • Міотонічна дистрофія

  • Гепато-лентикулярна дегенерація

  • Синдром ламкої Х-хромосоми

  • Спінально-бульбарна м’язова атрофія

  • Сімейна гіперхолестеринемія

  • Схильність до інсулінозалежного діабету

  • Фенілкетонурія

  • Хорея Гентінгтона

  • Прогресуюча м’язова дистрофія Ландузі-Дежерина

  • Мукополісахаридози

  • Гангліозидози

  • Лейкодистрофії

Тест-системи можуть бути використані для генетичного тестування, яке проводиться під час пренатальної діагностики, пресимптоматичної діагностики, для уточнення діагнозу та селективного і масового скринінгу гетерозиготних носіїв в групах високого ризику та в загальній популяції. Результати генетичного тестування є необхідною передумовою профілактики та прецизійного лікування, з метою покращення стану генофонду України та поліпшення демографічної ситуації

Граф логічної структури теми

Цитогенетичні, біохімічні та молекулярно-генетичні методи діагностики спадкової патології”

ЗМІСТОВИЙ МОДУЛЬ 3.

Пропедевтика спадкової патології

Тема: Семіотика спадкових захворювань.

Особливості проявів спадкових хвороб.

Морфогенетичні варіанти розвитку.

Вади розвитку.

Основні питання:

1. Семіотика спадкових захворювань.

  1. Особливості клінічних проявів природженої та спадкової патології.

  2. Загальні принципи клінічної діагностики природженої та спадкової патології.

  3. Особливості огляду та фізичного обстеження хворого і членів його родини.

  4. Природжені вади розвитку.

  5. Природжені морфогенетичні варіанти.

  6. Синдромологічний підхід у діагностиці природженої та спадкової патології.

Семіотика спадкової патології вивчає ознаки (симптоми) спадкових хвороб і патологічних станів, викликаних взаємодією спадкових і середовищні факторів. В основі особливостей клінічних проявів спадкової патології лежать генетичні закономірності дії та взаємодії генів.

Загальні ознаки спадкових хвороб:

  • сімейний характер захворювання;

  • хронічний, прогредієнтний, рецидивуючий перебіг;

  • наявність специфічних стигм дізембріогенезу;

  • множинні патологічні зміни органів і систем (плейотропна дія генів);

  • резистентність до найбільш поширених методів терапії.

Загальна лікарська підготовка включає знання основних ознак і особливостей клінічних проявів усіх форм спадкової патології, а також методику опису фенотипу.

Фенотип – це сукупність ознак, що проявляються в результаті дії генів у певних умовах серидовища. Клінічне обстеження хорих повинне включати опис фенотипу для пошуку симптомів, що дозволяли б установити синдромологічний діагноз. Термін «синдром» у клінічній генетиці використовують не стільки для констатації сукупності симптомів, скільки для визначення самостійних нозологічних форм.

При проведенні обстеження пробандів дотримуються стандартизованої класифікації клінічних, морфологічних, антропометричних та інших характеристик. Особливу увагу приділяють не тільки природженим вадам розвитку (ПВР), але й малим аномаліям розвитку (МАР).

Усі МАР розділяються на три групи:

  • альтернативні (ті ознаки, які або є, або їх немає);

  • вимірювальні (ознаки, що визначаються числовим значенням);

  • якісні (зміна форми м’яких тканин, кольору волосся, шкіри).

На відміну від ПВР, які теж мають морфологічні відхилення розвитку, МАР не викликають порушення фукнкції органу. Однак виявлення декількіх стигм дизембріогенезу повинне вказати кожному лікарю на необхідність більш детального обстеження хворого задля виключення у нього вродженої або спадкової патології.

Термін "природжена аномалія" (congenіtal anomaly) або синонім "уроджений дефект" (bіrth defect) використовується в міжнародній класифікації хвороб для позначення структурних, біохімічних і функціональних порушень, які присутні у новонароджених.

Виділяють чотири типи ПВР:

1. Мальформація (malformatіon) - морфологічний дефект органа, частини органа або великої ділянки тіла в результаті внутрішнього порушення процесу розвитку (генетичні фактори).

2. Дизрупція (dіsruptіon) - морфологічний дефект органа частини організму або великої ділянки тіла в результаті зовнішньої перешкоди або якого-небудь впливу на споконвічно нормальний процес розвитку (тератогенні фактори та порушення імплантації).

3. Деформація (deformatіon) - порушення форми, виду або положення частини тіла, обумовлене механічними впливами.

4. Дисплазія (dysplasіa) - порушена організація клітин у тканині (тканинах) і її морфологічний результат(и) (процес і наслідок дисгістогенезу).