- •Научные консультанты:
- •Сокращения и глоссарий
- •Введение
- •Обзор литературы
- •1.1 Торможение в гиппокампе
- •1.1.1 ГамКергическая синаптическая передача
- •1.1.2 ГамКергические рецепторы
- •1.1.3 Разнообразие форм торможения
- •1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения
- •1.2 Взаимодействие между глутамат и гамКергической системами
- •1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия
- •1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии
- •1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе
- •1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе
- •1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза
- •1.3.1 Исследования эпилептогенеза
- •1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
- •1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
- •1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
- •1.4 Постановка цели и задач исследования
- •2. Материалы и методы
- •2.1 Срезы гиппокампа
- •2.1.1 Приготовление и растворы
- •2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы
- •2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии
- •2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов
- •2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов
- •2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы
- •2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных
- •2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала
- •2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации
- •2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch
- •2.5.1 Приготовление outside-out patch
- •2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
- •2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа токов, полученных с outside-out пейчей
- •2.6 Модели эпилептогенеза in vivo
- •2.6.1 Электрический киндлинг
- •2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг
- •2.7 Использованные вещества
- •2.8 Статистический анализ
- •3 Результаты исследованИй и их обсуждение
- •3.1 Нетипичные фармакологические свойства гамКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах
- •3.1.1 Различная чувствительность ионотропных гамКергических рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках
- •3.1.2 Ионные каналы ионотропных гамКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость
- •3.1.3 Ионотропные гамКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту гамкс рецепторов
- •3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует гамКергические токи, вызываемые аппликацией caca (50 м)
- •3.1.5 Тпст в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 м пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к антагонисту гамкс рецепторов
- •3.1.6 Токи, опосредованные гамКергическими рецепторами, в присутствии 100 м пикротоксина возникают за счет характерной Cl-/hco3- ионой проводимости
- •3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов гамка рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов гамка и гамкс рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными фармакологическими свойствами
- •3.1.10 Нетипичные гамКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов (гамка и гамкс)
- •3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных гамКергических рецепторов в интернейронах
- •Заключение
- •3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет гамКергического тонического торможения
- •3.2.1 Базовый тонический гамКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток
- •3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации гамк ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах
- •3.2.3 Температурная зависимость тонического гамКергического тока и фазических спонтанных тпст
- •3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе
- •3.2.5 Заключение
- •3.3 Модуляция гамКергической передачи в гиппокампе метаботропными рецепторами
- •3.3.1 L-ap4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в интернейронах
- •Демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках са1.
- •3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает тпст
- •3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию тпст
- •3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на гетеросинаптическую депрессию
- •3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам
- •3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных тпст
- •3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии тпст при активации mGluR группы III
- •3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости нейрональной сети поля са1
- •3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными гамкb рецепторами
- •3.3.10 Заключение
- •3.4 Каинатные рецепторы модулируют гамКергическое торможение в гиппокампальных интернейронах
- •3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных тпст в интернейронах
- •3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов действия в интернейронах
- •3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия
- •3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы
- •3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными рецепторами, для гамКергической передачи
- •3.4.6 Каинат усиливает вызванные тпст в интернейронах
- •3.4.7 Каинат приводит к увеличению гамКергического тонического тока
- •3.4.8 Последствия усиления гамКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети
- •3.4.9 Заключение
- •3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы противоположное действие на гамКергическую передачу?
- •3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе
- •3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа
- •3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа не зависит от активности нейронов поля са3
- •3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле са1 в ответ на кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo
- •3.6.4 Является ли пачечная активность в поле са1 гиппокампа эпилептиформной?
- •3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля са1 генерировать пачечные разряды сопровождается повышением возбудимости этих клеток
- •3.6.6 Роль nmda рецепторов и l-типа кальциевых каналов в повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов
- •3.6.7 Заключение
- •Заключение
- •Клеткоспецифичность гамКергического торможения в гиппокампе
- •Клеткоспецифичность модуляции гамКергического торможения в гиппокампе
- •Возбудимость и торможение в эпилептогенезе
- •Эффектов веществ влияющих на гамКергические механизмы, описанные в данной диссертационной работе, представлена втаблице 4.1 (см также Рис. 4.1). Выводы
- •Список рисунков
- •Список литературы
Клеткоспецифичность гамКергического торможения в гиппокампе
В данной работе нам удалось показать, что распределение ГАМКергических рецепторов в гиппокампе, структуре, связанной с кратковременной памятью и вовлекаемой в некоторые формы эпилепсии, зависит от типа постсинаптической клетки. В частности, фармакологические и биофизические свойства ионотропных ГАМКергических рецепторов, принимающих участие в синаптической передаче, различаются в интернейронах и пирамидных клетках. Неожиданным оказалось, что чувствительность к пикротоксину ГАМКергической синаптической передачи в интернейронах намного ниже, чем в пирамидных клетках. С практической точки зрения, это значит, что традиционно используемая для блокады ТПСТ концентрация данного антагониста может не полностью подавлять ГАМКергические токи в интернейронах.
Другим клеткоспецифичным феноменом оказалась ГАМКергическая тоническая проводимость в интернейронах str.radiatumполя СА1. Так, мы показали, что в этих клетках при базовых условиях существует постоянный ГАМКергический ток, который фармакологически отличен от ГАМКергических ТПСТ. Причем, в возбуждающих пирамидных клетках этого тока обнаружено не было. Таким образом, в нормальном мозге активность интернейронов несколько подавлена тонически. Сам по себе, этот факт играет важную роль для понимания механизмов регуляции возбудимости нейрональных сетей. При этом фармакологическая специфичность тонического торможения в интернейронах является привлекательной как мишень для препаратов, снижающих или увеличивающих возбудимость нейрональной сети (см. также раздел 3.2.4).
Нужно отметить, что повышение внеклеточной концентрации ГАМК, которое в наших экспериментах было получено при блокировании обратного захвата (uptake) медиатора, приводило к возникновению ГАМКергического тонического тока как в интернейронах, так и в пирамидных клетках. Подобная ситуация с увеличением в мозге ГАМК может наблюдаться при эпилептогенезе (Treiman 2001) и может служить защитным механизмом, подавляя активность пирамидных клеток. Однако, данный тип тонической проводимосте не специфичен только для пирамидных клеток. Повышение тонического торможения интернейронов может оказывать проэпилептогенный эффект.
Клеткоспецифичность модуляции гамКергического торможения в гиппокампе
Помимо клеткоспецифичности различных форм ГАМКергического торможения в гиппокампе, в представленной работе была продемонстрирована клеткоспецифичность модуляции ГАМКергической передачи глутаматергическими гетерорецепторами: каинатными и метаботропными. Так было показано, что метаботропные рецепторы группы IIIселективно подавляют выброс медиатора в тормозных ГАМКергических терминалях, оканчивающихся на интернейронахstr.radiatumполя СА1 гиппокампа, но не в терминалях на возбуждающих пирамидных клетках. С другой стороны, было показано, что аксональные каинатные рецепторы увеличивают возбудимость пресинаптических терминалей, образующих синапсы на интернейронах. Тем не менее, при кажущейся противоположности эффектов совместной активации данных рецепторов, их действие может быть комплиментарным. Для объяснения этого парадокса, мы предложили идею фильтра “сигнал-шум” (см. раздел 3.5). Смысл ее заключается в том, что метаботропные рецепторы подавляют спонтанный выброс ГАМК в синапсах расположенных на интернейронах, снижая фоновое торможение (“шум”) этих клеток. Активация каинатных рецепторов, в данном случае, увеличивает возбудимость терминалей и, соответственно, вероятность генерации в них потенциалов действия (“сигнал”). Таким образом, значимая информация передается эффективно в системе синаптических ГАМКергических связей между интернейронами, тогда как их фоновое торможение снижено.
Помимо клеточной специфичности модуляции ГАМКергической передачи глутаматергическим гетерорецепторами, важным результатом является сама возможность несинаптического взаимодействия между возбуждающей и тормозной системами. Полученные данные указывают на важную роль диффузной нейропередачи (спилловера нейропередатчиков) для нормального функционирования мозга. Возможно, принимая во внимание этот тип взаимодействий, удастся создать более реалистичную модель обработки информации в ЦНС. Несомненно, внесинаптические эффекты не ограничиваются только влиянием глутамата на ГАМКергическую тормозную нейропередачу. Внеклеточная ГАМК также эффективна как модулятор. Этот эндогенный агонист, действуя внесинаптически, принимает участие в тоническом (постоянном) торможении клеток, может регулировать выброс медиатора, действуя через метаботропные ГАМКВрецепторы как в тормозных (см. раздел 3.3.9), так и в возбуждающих синапсах (Isaacson 2000; Isaacson et al. 1993; Mott and Lewis 1994). По аналогии с каинатными рецепторами, ионотропные аксональные ГАМКАрецепторы регулируют возбудимость терминалей и вероятность возникновения в них потенциалов действия (Stasheff et al. 1993). Нам также удалось получить данные о снижении возбудимости коллатералей Шаффера при внеклеточной аппликации муцимола (агониста ионотропных ГАМКергических рецепторов). Эти данные не были представлены в данной диссертационной работе, поскольку выходили за пределы цели и задач. Кроме того, за пределами представленной работы остались полученные нами данные о холинергической модуляции ГАМКергической передачи в гиппокампальных интернейронах, опосредованной никотиновыми рецепторами. Таким образом, помимо представленных здесь данных, существует ряд свидетельств внесинаптических эффектов связанных с другими системами нейропередачи. Исходя из этого, можно заключить, что для нормальной работы мозга помимо синаптической нейропередачи важную роль играют внесинаптические диффузные факторы. Причем, как синаптическая система, так и внесинаптическая являются клеткоспецифичными.